Alternativ spleising - Alternative splicing

Alternativ spleising produserer tre proteiner isoformer . Protein A inkluderer alle eksonene, mens protein B og C er et resultat av hopping av exon .

Alternativ spleising , eller alternativ RNA -spleising , eller differensiell spleising , er en alternativ spleiseprosess under genuttrykk som gjør at et enkelt gen kan kode for flere proteiner . I denne prosessen kan bestemte eksoner av et gen inkluderes i eller utelukkes fra det endelige, behandlede messenger -RNA (mRNA) produsert fra det genet. Dette betyr at eksonene er forbundet i forskjellige kombinasjoner, noe som fører til forskjellige (alternative) mRNA -tråder. Følgelig vil proteiner oversatt fra alternativt spleisede mRNA inneholde forskjeller i aminosyresekvensen og ofte i deres biologiske funksjoner (se figur). Spesielt lar alternativ spleising det menneskelige genomet styre syntesen av mange flere proteiner enn det som kan forventes fra dets 20 000 proteinkodende gener.

Alternativ spleising forekommer som et normalt fenomen i eukaryoter , hvor det øker biologisk mangfold av proteiner som kan kodes av genomet; hos mennesker er ~ 95% av multi-eksoniske gener alternativt spleiset. Det er mange forskjellige alternativer for spleising observert, hvorav det vanligste er å hoppe over . I denne modusen kan en bestemt ekson inkluderes i mRNA under visse forhold eller i bestemte vev, og utelates fra mRNA i andre.

Produksjonen av alternativt spleisede mRNA reguleres av et system av transvirkende proteiner som binder seg til cis-virkende steder på selve primærutskriften . Slike proteiner inkluderer spleiseaktivatorer som fremmer bruken av et bestemt spleisested, og spleiserepressorer som reduserer bruken av et bestemt sted. Mekanismer for alternativ spleising er svært varierende, og nye eksempler blir stadig funnet, spesielt ved bruk av teknikker med høy gjennomstrømning. Forskere håper å fullstendig belyse reguleringssystemene som er involvert i spleising, slik at alternative spleiseprodukter fra et gitt gen under spesielle forhold ("spleisingsvarianter") kan forutsies av en "spleisingskode".

Unormale variasjoner i spleising er også implisert i sykdom ; en stor andel av menneskelige genetiske lidelser skyldes spleisingsvarianter. Unormale spleisingsvarianter antas også å bidra til utviklingen av kreft, og spleiseringsfaktorgener blir ofte mutert i forskjellige typer kreft.

Oppdagelse

Alternativ spleising ble først observert i 1977. Adenovirus produserer fem primære transkripsjoner tidlig i sin smittsomme syklus, før viral DNA -replikasjon, og ytterligere en senere, etter at DNA -replikasjon begynner. De tidlige primære transkripsjonene fortsetter å bli produsert etter at DNA -replikasjon begynner. Den ekstra primære transkripsjonen som produseres sent i infeksjonen er stor og kommer fra 5/6 av 32 kb adenovirusgenomet. Dette er mye større enn noen av de individuelle adenovirus -mRNAene som er tilstede i infiserte celler. Forskere fant at det primære RNA -transkriptet produsert av adenovirus type 2 i senfasen ble spleiset på mange forskjellige måter, noe som resulterte i at mRNA koder for forskjellige virale proteiner. I tillegg inneholdt den primære transkripsjonen flere polyadenyleringssteder , noe som ga forskjellige 3' -ender for de behandlede mRNA -ene.

I 1981 ble det første eksemplet på alternativ spleising i et transkripsjon fra et normalt, endogent gen karakterisert. Genet som koder for thyroid hormon kalsitonin ble funnet å være alternativt spleiset i pattedyrceller. Den primære transkripsjonen fra dette genet inneholder 6 eksoner; den kalsitonin mRNA inneholder eksoner 1-4 og opphører etter et polyadenylerings -setet i exon 4. Et annet mRNA som er produsert fra denne pre-mRNA ved å hoppe over exon 4, og omfatter exoner 1-3, 5 og 6. Det koder for et protein som er kjent som CGRP ( kalsitonin -genrelatert peptid ). Eksempler på alternativ spleising i immunglobin -genutskrifter hos pattedyr ble også observert på begynnelsen av 1980 -tallet.

Siden da har alternativ spleising blitt funnet å være allestedsnærværende i eukaryoter. " Rekordholder " for alternativ spleising er et D. melanogaster- gen kalt Dscam , som potensielt kan ha 38.016 spleisevarianter.

I 2021 ble det oppdaget at genomet til adenovirus type 2, adenoviruset der alternativ spleising først ble identifisert, var i stand til å produsere et mye større utvalg av mRNA enn tidligere antatt. Ved å bruke neste generasjons sekvenseringsteknologi, var forskere i stand til å oppdatere det humane adenovirus type 2-transkriptom, og presentere et heftig 904 unikt mRNA, produsert av viruset gjennom et komplekst mønster av alternativ spleising.

Modi

Tradisjonell klassifisering av grunnleggende typer alternative RNA -spleisearrangementer. Exoner er representert som blå og gule blokker, introner som linjer mellom.
Relative frekvenser for typer alternative spleisearrangementer varierer mellom mennesker og fruktfluer.

Fem grunnleggende metoder for alternativ spleising er generelt anerkjent.

  • Exon hoppe eller kassett exon : i dette tilfellet, et ekson kan bli spleiset ut av det primære transkript eller beholdt. Dette er den vanligste modusen hos pattedyr pre-mRNA .
  • Gjensidig eksklusive eksoner : En av to eksoner beholdes i mRNA etter spleising, men ikke begge.
  • Alternativt donorsted : Et alternativt 5 'spleisekryss (donorsted) brukes, og endrer 3' -grensen til oppstrøms ekson.
  • Alternativt akseptorsted : Et alternativt 3 'spleisekryss (akseptorsted) brukes, og endrer 5' -grensen til nedstrøms ekson.
  • Intronretensjon : En sekvens kan spleises ut som et intron eller ganske enkelt beholdes. Dette skilles fra exon -hopping fordi den beholdte sekvensen ikke er flankert av introner . Hvis det beholdte intronet er i kodingsområdet, må intronet kode aminosyrer i ramme med de nærliggende eksonene, eller et stoppkodon eller et skifte i leserammen vil føre til at proteinet ikke er funksjonelt. Dette er den sjeldneste modusen hos pattedyr.

I tillegg til disse primære modusene for alternativ spleising, er det to andre hovedmekanismer som forskjellige mRNA kan genereres fra det samme genet; flere promotorer og flere polyadenyleringssteder . Bruk av flere promotorer er riktig beskrevet som en transkripsjonell reguleringsmekanisme i stedet for alternativ spleising; ved å starte transkripsjon på forskjellige punkter, kan transkripsjoner med forskjellige 5'-mest eksoner genereres. I den andre enden gir flere polyadenyleringssteder forskjellige 3' -endepunkter for transkripsjonen. Begge disse mekanismene finnes i kombinasjon med alternativ spleising og gir ytterligere variasjon i mRNA som er avledet fra et gen.

Skjematisk cutoff fra 3 spleisestrukturer i det murine hyaluronidase -genet. Transkripsjonens retning fra 5 'til 3' er vist fra venstre til høyre. Eksoner og introner tegnes ikke i målestokk.


Disse modusene beskriver grunnleggende spleisemekanismer, men kan være utilstrekkelige til å beskrive komplekse spleisingshendelser. For eksempel viser figuren til høyre 3 spleiseformer fra musen hyaluronidase 3 -genet. Å sammenligne den eksoniske strukturen som vises i den første linjen (grønn) med den i den andre linjen (gul) viser intronretensjon, mens sammenligningen mellom den andre og den tredje spliceformen (gul vs. blå) viser eksonhopp. En modellnomenklatur for å unikt betegne alle mulige spleisemønstre har nylig blitt foreslått.

Mekanismer

Generell spleisemekanisme

Spliceosome A -kompleks definerer 5 'og 3' ender av intronet før fjerning

Når pre-mRNA er transkribert fra DNA , inkluderer det flere introner og eksoner . (Hos nematoder er gjennomsnittet 4-5 eksoner og introner; i fruktfluen Drosophila kan det være mer enn 100 introner og eksoner i ett transkribert pre-mRNA.) Eksonene som skal beholdes i mRNA bestemmes under spleiseprosessen . Regulering og valg av spleisesteder utføres av transvirkende spleiseaktivator- og spleiserepressorproteiner samt cis-virkende elementer i selve pre-mRNA, slik som eksoniske spleiseforsterkere og eksoniske spleisningsdempere.

Det typiske eukaryote atomintronet har konsensus -sekvenser som definerer viktige regioner. Hver intron har sekvensen GU i sin 5' -ende. I nærheten av 3' -enden er det et filialområde. Nukleotidet ved grenpunktet er alltid et A; konsensus rundt denne sekvensen varierer noe. Hos mennesker er grenens konsensus -sekvens YUnAy. Forgreningsstedet etterfølges av en serie pyrimidiner - polypyrimidinkanalen - deretter av AG i 3' -enden .

Spleising av mRNA utføres av et RNA- og proteinkompleks kjent som spliceosomet , som inneholder snRNPer betegnet U1, U2 , U4, U5 og U6 (U3 er ikke involvert i mRNA -spleising). U1 binder seg til 5 'GU og U2, ved hjelp av U2AF -proteinfaktorene , binder det seg til grenpunktet A på grenstedet. Komplekset på dette stadiet er kjent som spliceosome A -komplekset. Dannelse av A -komplekset er vanligvis det viktigste trinnet i å bestemme endene på intronet som skal spleises ut, og definere endene på exonet som skal beholdes. (U -nomenklaturen stammer fra deres høye uridininnhold).

U4, U5, U6 -komplekset binder seg, og U6 erstatter U1 -posisjonen. U1 og U4 går. Det gjenværende komplekset utfører deretter to transesterifiseringsreaksjoner . I den første transesterifikasjonen spaltes 5'-enden av intronet fra eksonet oppstrøms og kobles til forgreningsstedet A ved en 2 ', 5'- fosfodiesterbinding . I den andre transesterifikasjonen spaltes 3' -enden av intronet fra exonet nedstrøms, og de to eksonene er forbundet med en fosfodiesterbinding. Intronet frigjøres deretter i lariatform og nedbrytes.

Reguleringselementer og proteiner

Splicing undertrykkelse

Spleising reguleres av transvirkende proteiner (repressorer og aktivatorer) og tilsvarende cis-virkende regulatoriske steder (lyddempere og forsterkere) på pre-mRNA. Som en del av kompleksiteten ved alternativ spleising bemerkes det imidlertid at effekten av en spleisingsfaktor ofte er posisjonsavhengig. Det vil si at en spleisingsfaktor som fungerer som en spleiseaktivator når den er bundet til et intronisk forsterkerelement, kan tjene som en repressor når den er bundet til spleiselementet i konteksten til et ekson, og omvendt. Sekundærstrukturen til pre-mRNA-transkripsjonen spiller også en rolle i regulering av spleising, for eksempel ved å bringe sammen spleiselementer eller ved å maskere en sekvens som ellers ville fungere som et bindingselement for en spleisingsfaktor. Sammen danner disse elementene en "spleisingskode" som styrer hvordan spleising vil skje under forskjellige mobilforhold.

Det er to hovedtyper av cis-virkende RNA-sekvenselementer som er tilstede i pre-mRNA, og de har tilsvarende transvirkende RNA-bindende proteiner . Splisende lyddempere er steder som spleiserepressorproteiner binder seg til, noe som reduserer sannsynligheten for at et sted i nærheten vil bli brukt som et spleisekryss. Disse kan være lokalisert i selve intronet (intronic splicing silencers, ISS) eller i en naboexon ( exonic splicing silencers , ESS). De varierer i rekkefølge, så vel som i proteintypene som binder seg til dem. Flertallet av spleiserepressorer er heterogene kjernefysiske ribonukleoproteiner (hnRNPs) som hnRNPA1 og polypyrimidin -traktbinding protein (PTB). Spleise enhancere er områder til hvilke spleising aktivatorproteiner bind, øker sannsynligheten for at et nærliggende område vil bli brukt som en spleiseforbindelse. Disse kan også forekomme i intronet (intronic splicing enhancers, ISE) eller exon ( exonic splicing enhancers , ESE). De fleste aktivatorproteinene som binder seg til ISE og ESE er medlemmer av SR -proteinfamilien . Slike proteiner inneholder RNA-gjenkjenningsmotiver og arginin- og serinrike (RS) domener.

Splicing aktivering

Generelt fungerer determinanter for spleising på en interavhengig måte som er avhengig av kontekst, slik at reglene for spleising reguleres fra en spleisekode. Tilstedeværelsen av et bestemt cis-virkende RNA-sekvenselement kan øke sannsynligheten for at et sted i nærheten vil spleises i noen tilfeller, men redusere sannsynligheten i andre tilfeller, avhengig av kontekst. Konteksten innenfor hvilken regulatoriske elementer virker inkluderer cis-virkende kontekst som etableres ved tilstedeværelse av andre RNA-sekvensfunksjoner, og transvirkende kontekst som er etablert av cellulære forhold. For eksempel påvirker noen cis-virkende RNA-sekvenselementer spleising bare hvis flere elementer er tilstede i samme region for å etablere kontekst. Som et annet eksempel kan et cis-virkende element ha motsatte effekter på spleising, avhengig av hvilke proteiner som uttrykkes i cellen (f.eks. Neuronal versus non-neuronal PTB). Den adaptive betydningen av spleising av lyddempere og forsterkere bekreftes av studier som viser at det er sterk seleksjon i menneskelige gener mot mutasjoner som produserer nye lyddempere eller forstyrrer eksisterende forsterkere.

DNA -metylering og alternativ spleising i sosiale insekter

CpG DNA -metylering har vist en rolle for å regulere alternativ spleising i sosiale insekter. Hos honningbier ( Apis mellifera ) ser det ut til at CpG DNA -metylering regulerer eksonhoppingen basert på de første få genomiske studiene etter at honningbiens genom var tilgjengelig. CpG DNA -metylering regulerte alternativ spleising mer omfattende, påvirker ikke bare exon -hopp, men også intronretensjon og andre spleisingshendelser.

Eksempler

Exon hopper over: Drosophila dsx

Alternativ spleising av dsx pre-mRNA

Pre-mRNA fra D. melanogaster genet dsx inneholder 6 eksoner. Hos menn er eksoner 1,2,3,5 og 6 forbundet for å danne mRNA, som koder for et transkripsjonelt regulatorisk protein som kreves for mannlig utvikling. Hos kvinner er eksoner 1,2,3 og 4 forbundet, og et polyadenyleringssignal i ekson 4 forårsaker spaltning av mRNA på det tidspunktet. Det resulterende mRNA er et transkripsjonelt regulatorisk protein som kreves for kvinnelig utvikling.

Dette er et eksempel på exon -hopp. Intronet oppstrøms fra ekson 4 har en polypyrimidin -kanal som ikke samsvarer godt med konsensus -sekvensen , slik at U2AF -proteiner binder seg dårlig til det uten hjelp fra spleiseaktivatorer. Dette 3 'spleiseacceptorstedet brukes derfor ikke hos menn. Hunnene produserer imidlertid spleiseaktivatoren Transformer (Tra) (se nedenfor). SR -proteinet Tra2 produseres i begge kjønn og binder seg til en ESE i ekson 4; hvis Tra er tilstede, binder det seg til Tra2 og danner sammen med et annet SR -protein et kompleks som hjelper U2AF -proteiner med å binde seg til det svake polypyrimidin -området. U2 rekrutteres til det tilhørende grenpunktet, og dette fører til inkludering av exon 4 i mRNA.

Alternative akseptorsteder: Drosophila Transformator

Alternativ spleising av genproduktet Drosophila Transformer .

Pre-mRNAs av Transformer (Tra) genet til Drosophila melanogaster gjennomgår alternativ spleising via alternativ acceptor site-modus. Genet Tra koder for et protein som bare uttrykkes hos kvinner. Den primære transkripsjonen av dette genet inneholder et intron med to mulige akseptorseter. Hos menn brukes oppstrøms akseptorsted. Dette fører til at en lengre versjon av exon 2 blir inkludert i det behandlede transkriptet, inkludert et kodon for tidlig stopp . Det resulterende mRNA koder for et avkortet proteinprodukt som er inaktivt. Hunnene produserer hovedkjønnsbestemmelsesproteinet Sex dødelig (Sxl). Sxl -proteinet er en spleiserepressor som binder seg til et ISS i RNA på Tra -transkripsjonen nær oppstrøms akseptorsetet, og forhindrer at U2AF -protein bindes til polypyrimidin -kanalen. Dette forhindrer bruk av dette veikrysset, og flytter spliceosombindingen til det nedstrøms akseptorsetet. Spleising på dette tidspunktet omgår stoppkodonet, som er skåret ut som en del av intronet. Det resulterende mRNA koder for et aktivt Tra-protein, som i seg selv er en regulator for alternativ spleising av andre kjønnsrelaterte gener (se dsx ovenfor).

Exon definisjon: Fas reseptor

Alternativ spleising av Fas-reseptoren pre-mRNA

Flere isoformer av Fas -reseptorproteinet produseres ved alternativ spleising. To normalt forekommende isoformer hos mennesker produseres av en mekanisme som hopper over. Et mRNA inkludert ekson 6 koder for membranbundet form av Fas-reseptoren, som fremmer apoptose eller programmert celledød. Økt ekspresjon av Fas-reseptor i hudceller kronisk utsatt for sol og fravær av uttrykk i hudkreftceller, tyder på at denne mekanismen kan være viktig for eliminering av pre-kreftceller hos mennesker. Hvis ekson 6 hoppes over, koder det resulterende mRNA for et løselig Fas -protein som ikke fremmer apoptose. Inkluderingen eller hoppingen av eksonen avhenger av to antagonistiske proteiner, TIA-1 og polypyrimidin-traktbindende protein (PTB).

  • 5'-donorstedet i intronet nedstrøms fra exon 6 i pre-mRNA har en svak overensstemmelse med konsensus-sekvensen, og er vanligvis ikke bundet av U1 snRNP. Hvis U1 ikke binder, hoppes eksonen over (se "a" i medfølgende figur).
  • Binding av TIA-1-protein til et intronisk skjøteforsterker-sted stabiliserer bindingen av U1-snRNP. Det resulterende 5 'donor -stedskomplekset hjelper til med å binde spleisningsfaktoren U2AF til 3' -spleisingsstedet oppstrøms eksonen, gjennom en mekanisme som ennå ikke er kjent (se b).
  • Exon 6 inneholder en pyrimidinrik eksonisk skjøtingsdemper, ure6 , der PTB kan binde seg. Hvis PTB binder, hemmer det effekten av 5' -donorkomplekset på bindingen av U2AF til akseptorstedet, noe som resulterer i eksonhopp (se c).

Denne mekanismen er et eksempel på ekson definisjon i spleising. Et spliceosom samles på et intron, og snRNP -underenhetene bretter RNA slik at 5 'og 3' ender av intronet er forbundet. Nylig studerte eksempler som dette viser imidlertid at det også er interaksjoner mellom endene på eksonen. I dette spesielle tilfellet er disse eksondefinisjonsinteraksjonene nødvendige for å tillate binding av kjernespleisefaktorer før montering av spliceosomene på de to flankerende intronene.

Repressor-aktivator-konkurranse: HIV-1 tat exon 2

Alternativ spleising av HIV-1 tat exon 2

HIV , retroviruset som forårsaker AIDS hos mennesker, produserer et enkelt primært RNA -transkript, som alternativt er spleiset på flere måter for å produsere over 40 forskjellige mRNA. Likevekt blant differensielt spleisede transkripsjoner gir flere mRNA som koder for forskjellige produkter som er nødvendige for virusmultiplikasjon. En av de differensielt spleisede transkripsjonene inneholder tat -genet, der ekson 2 er en kassettekson som kan hoppes over eller inkluderes. Inkluderingen av tat exon 2 i RNA reguleres av konkurranse mellom spleiserepressoren hnRNP A1 og SR -proteinet SC35. Innenfor exon 2 overlapper en eksonisk splicing -lyddemper -sekvens (ESS) og en exonic splicing enhancer -sekvens (ESE). Hvis A1 -repressorprotein binder seg til ESS, initierer det kooperativ binding av flere A1 -molekyler, som strekker seg inn i 5' -donorstedet oppstrøms for ekson 2 og forhindrer binding av kjernespleisingsfaktoren U2AF35 til polypyrimidin -kanalen. Hvis SC35 binder seg til ESE, forhindrer det A1 -binding og opprettholder 5' -donorstedet i en tilgjengelig tilstand for montering av spliceosomet. Konkurranse mellom aktivatoren og repressoren sikrer at begge mRNA -typene (med og uten ekson 2) produseres.

Adaptiv betydning

Alternativ spleising er et av flere unntak fra den opprinnelige ideen om at en DNA-sekvens koder for ett polypeptid ( ett-genet-ett-enzymhypotesen ). Det kan være mer riktig nå å si "Ett gen - mange polypeptider". Ekstern informasjon er nødvendig for å bestemme hvilket polypeptid som produseres, gitt en DNA-sekvens og pre-mRNA. Siden reguleringsmetodene er arvet, gir dette nye måter for mutasjoner å påvirke genuttrykk på.

Det har blitt foreslått at for eukaryoter var alternativ spleising et veldig viktig skritt mot høyere effektivitet, fordi informasjon kan lagres mye mer økonomisk. Flere proteiner kan kodes av et enkelt gen, i stedet for å kreve et eget gen for hvert, og dermed tillate et mer variert proteom fra et genom av begrenset størrelse. Det gir også evolusjonær fleksibilitet. En enkelt punktmutasjon kan føre til at en gitt ekson av og til blir ekskludert eller inkludert fra en transkripsjon under spleising, slik at produksjon av en ny proteinisoform uten tap av det opprinnelige proteinet. Studier har identifisert egens forstyrrede regioner (se Egens ustrukturerte proteiner ) som beriket med de ikke-konstituerende eksonene som antyder at proteinisoformer kan vise funksjonelt mangfold på grunn av endring av funksjonelle moduler i disse regionene. Et slikt funksjonelt mangfold oppnådd av isoformer reflekteres av uttrykksmønstrene deres og kan forutsies av maskinlæringsmetoder. Sammenlignende studier indikerer at alternativ spleising gikk foran multicellularitet i evolusjonen, og antyder at denne mekanismen kan ha blitt valgt for å hjelpe til med utviklingen av flercellede organismer.

Forskning basert på Human Genome Project og annen genom -sekvensering har vist at mennesker bare har omtrent 30% flere gener enn rundormen Caenorhabditis elegans , og bare omtrent dobbelt så mange som fluen Drosophila melanogaster . Dette funnet førte til spekulasjoner om at den oppfattede større kompleksiteten hos mennesker, eller virveldyr generelt, kan skyldes høyere forekomst av alternativ spleising hos mennesker enn det finnes hos virvelløse dyr. Imidlertid fant en studie på prøver på 100 000 EST hver fra mennesker, mus, rotter, ku, flue ( D. melanogaster ), orm ( C. elegans ) og planten Arabidopsis thaliana ingen store forskjeller i frekvens av alternativt spleisede gener blant mennesker og noen av de andre dyrene som ble testet. En annen studie foreslo imidlertid at disse resultatene var en artefakt av det forskjellige antallet EST som er tilgjengelig for de forskjellige organismer. Da de sammenlignet alternative spleisefrekvenser i tilfeldige undersett av gener fra hver organisme, konkluderte forfatterne med at virveldyr har høyere frekvens av alternative spleising enn virvelløse dyr.

Sykdom

Endringer i RNA-behandlingsmaskineriet kan føre til mis-spleising av flere transkripsjoner, mens endringer i enkelt-nukleotid i spleisesteder eller cis-virkende spleisereguleringssteder kan føre til forskjeller i spleising av et enkelt gen, og dermed i mRNA produsert fra en mutantgenets transkripsjoner. En studie i 2005 med sannsynlighetsanalyser indikerte at mer enn 60% av menneskelige sykdomsfremkallende mutasjoner påvirker spleising i stedet for direkte å påvirke kodesekvenser. En nyere studie indikerer at en tredjedel av alle arvelige sykdommer sannsynligvis vil ha en spleisekomponent. Uavhengig av nøyaktig prosentandel, eksisterer det en rekke spleiserelaterte sykdommer. Som beskrevet nedenfor er et fremtredende eksempel på spleiserelaterte sykdommer kreft.

Unormalt spleisede mRNA finnes også i en høy andel kreftceller. Kombinerte RNA-Seq- og proteomics-analyser har avslørt slående differensialuttrykk av spleiseisoformer av viktige proteiner i viktige kreftveier. Det er ikke alltid klart om slike avvikende spleisemønstre bidrar til kreftveksten, eller bare er en konsekvens av cellulære abnormiteter forbundet med kreft. For visse typer kreft, som i kolorektal og prostata, har antallet spleisingsfeil per kreft vist seg å variere sterkt mellom individuelle kreftformer, et fenomen som kalles transkriptom ustabilitet . Transkriptom ustabilitet har videre vist seg å korrelere fett med redusert ekspresjonsnivå for spleiseringsfaktorgener. Mutasjon av DNMT3A har vist seg å bidra til hematologiske maligniteter , og at DNMT3A -muterte cellelinjer viser transkriptom ustabilitet sammenlignet med deres isogene villtype -kolleger.

Faktisk er det faktisk en reduksjon av alternativ spleising i kreftceller sammenlignet med normale, og spleisingstypene er forskjellige; for eksempel viser kreftceller høyere nivåer av intronretensjon enn normale celler, men lavere nivåer av eksonhopp. Noen av forskjellene i spleising i kreftceller kan skyldes den høye frekvensen av somatiske mutasjoner i spleiseringsfaktorgener, og noen kan skyldes endringer i fosforylering av transvirkende spleisefaktorer. Andre kan bli produsert av endringer i de relative mengdene av spleisefaktorer som produseres; for eksempel har brystkreftceller vist seg å ha økte nivåer av spleisingsfaktoren SF2/ASF . En studie fant at en relativt liten prosentandel (383 av over 26000) av alternative spleisingsvarianter var signifikant høyere i frekvens i svulstceller enn normale celler, noe som tyder på at det er et begrenset sett med gener som, når de er misledd, bidrar til svulst utvikling. Det antas imidlertid at de skadelige effektene av feilskrevne transkripsjoner vanligvis beskyttes og elimineres av en cellulær posttranskripsjonell kvalitetskontrollmekanisme kalt Nonsense-mediert mRNA-forfall [NMD].

Ett eksempel på en spesifikk spleisingsvariant assosiert med kreft er i et av de menneskelige DNMT -genene. Tre DNMT -gener koder for enzymer som tilfører metylgrupper til DNA, en modifikasjon som ofte har regulatoriske effekter. Flere unormalt spleisede DNMT3B -mRNA finnes i svulster og kreftcellelinjer. I to separate studier forårsaket ekspresjon av to av disse unormalt spleisede mRNAene i pattedyrceller endringer i DNA -metyleringsmønstrene i disse cellene. Celler med en av de unormale mRNAene vokste også dobbelt så raskt som kontrollceller, noe som indikerer et direkte bidrag til tumorutvikling av dette produktet.

Et annet eksempel er proto-onkogenet fra Ron ( MST1R ) . En viktig egenskap for kreftceller er deres evne til å bevege seg og invadere normalt vev. Produksjon av en unormalt spleiset transkripsjon av Ron har vist seg å være assosiert med økte nivåer av SF2/ASF i brystkreftceller. Den unormale isoformen til Ron -proteinet som er kodet av dette mRNA, fører til cellemotilitet .

Overuttrykk av en avkortet spleisevariant av FOSB -genet - ΔFosB - i en spesifikk populasjon av nevroner i nucleus accumbens har blitt identifisert som årsaksmekanismen som er involvert i induksjon og vedlikehold av avhengighet til medisiner og naturlige belønninger .

Nylige provoserende studier peker på en nøkkelfunksjon av kromatinstruktur og histonendringer i alternativ spleiseregulering. Disse innsiktene antyder at epigenetisk regulering ikke bare bestemmer hvilke deler av genomet som uttrykkes, men også hvordan de spleises.

Genomfattende analyse

Genomeomfattende analyse av alternativ spleising er en utfordrende oppgave. Vanligvis er det funnet alternativt spleisede transkripsjoner ved å sammenligne EST -sekvenser, men dette krever sekvensering av svært stort antall EST -er. De fleste EST-biblioteker kommer fra et svært begrenset antall vev, så vevsspesifikke spleisevarianter vil sannsynligvis bli savnet i alle fall. Det er imidlertid utviklet tilnærminger med høy gjennomstrømning for å undersøke spleising, for eksempel: DNA-mikroarray- baserte analyser, RNA-bindende analyser og dyp sekvensering . Disse metodene kan brukes til å screene for polymorfismer eller mutasjoner i eller rundt spleiselementer som påvirker proteinbinding. Når de kombineres med spleisingsanalyser, inkludert in vivo reportergenanalyser , kan de funksjonelle effektene av polymorfismer eller mutasjoner på spleising av pre-mRNA-transkripsjoner deretter analyseres.

I mikromatriseanalyse, rekker av DNA-fragmenter som representerer individuelle exoner ( for eksempel Affymetrix exon microarray) eller exon / exon grenser ( f.eks arrays fra ExonHit eller Jivan ) har blitt benyttet. Arrayen blir deretter sonderet med merket cDNA fra vev av interesse. Proben cDNA bindes til DNA fra eksonene som er inkludert i mRNA i opprinnelsesvevet, eller til DNA fra grensen hvor to eksoner er blitt forbundet. Dette kan avsløre tilstedeværelsen av bestemte alternativt spleisede mRNAer.

CLIP ( Cross-linking and immunoprecipitation ) bruker UV-stråling for å koble proteiner til RNA-molekyler i et vev under spleising. Et transvirkende spleisende regulatorisk protein av interesse blir deretter utfelt ved bruk av spesifikke antistoffer. Når RNA festet til det proteinet er isolert og klonet, avslører det målsekvensene for det proteinet. En annen metode for å identifisere RNA-bindende proteiner og kartlegge deres binding til pre-mRNA-transkripsjoner er "Microarray Evaluation of Genomic Aptamers by shift (MEGAshift)". Net Denne metoden innebærer en tilpasning av "Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment (SELEX) "-metode sammen med en mikroarray-basert avlesning. Bruk av MEGAshift-metoden har gitt innsikt i reguleringen av alternativ spleising ved å tillate identifisering av sekvenser i pre-mRNA-transkripsjoner som omgir alternativt spleisede eksoner som medierer binding til forskjellige spleisingsfaktorer, for eksempel ASF/SF2 og PTB. Denne tilnærmingen har også blitt brukt for å bestemme forholdet mellom RNA -sekundærstruktur og bindingen av spleisefaktorer.

Dyp sekvenseringsteknologi har blitt brukt til å utføre genomomfattende analyser av mRNA-ubehandlet og behandlet-og dermed gi innsikt i alternativ spleising. For eksempel indikerer resultater fra bruk av dyp sekvensering at anslagsvis 95% av transkripsjoner fra multiexon-gener hos mennesker gjennomgår alternativ spleising hos mennesker, med et antall pre-mRNA-transkripsjoner spleiset på en vevsspesifikk måte. Funksjonell genomikk og beregningsmessige tilnærminger basert på læring av flere forekomster har også blitt utviklet for å integrere RNA-seq-data for å forutsi funksjoner for alternativt spleisede isoformer. Dyp sekvensering har også hjulpet til med in vivo- påvisning av de forbigående lariatene som frigjøres under spleising, bestemmelse av sekvenser for grensted og storstilt kartlegging av grenpunkter i humane pre-mRNA-transkripsjoner.

Bruk av reporteranalyser gjør det mulig å finne spleiseproteinene som er involvert i en spesifikk alternativ spleisingshendelse ved å konstruere reportergener som vil uttrykke ett av to forskjellige fluorescerende proteiner avhengig av spleisereaksjonen som oppstår. Denne metoden har blitt brukt til å isolere mutanter som påvirker spleising og dermed identifisere nye spleisende regulatoriske proteiner som er inaktivert i disse mutantene.

Databaser

Det er en samling av alternative spleisingsdatabaser. Disse databasene er nyttige for å finne gener som har pre-mRNA som gjennomgår alternativ spleising og alternative spleisingshendelser eller for å studere den funksjonelle effekten av alternativ spleising.

Se også

Referanser

Eksterne linker