Cellefritt foster -DNA - Cell-free fetal DNA

Cellefri føtalt DNA ( cffDNA ) er føtalt DNA som sirkulerer fritt i morens blod . Moderblod prøvetas ved venepunktur . Analyse av cffDNA er en metode for ikke-invasiv prenatal diagnose som ofte bestilles for gravide kvinner i avansert mors alder . To timer etter levering er cffDNA ikke lenger påviselig i moderblod.

Bakgrunn

Cellefritt foster-DNA skyller inn i mors blodsirkulasjon.

cffDNA stammer fra placenta trofoblaster . Foster -DNA blir fragmentert når mikropartikler fra morkaken skylles ut i mors blodsirkulasjon .

cffDNA -fragmenter er omtrent 200 basepar (bp) i lengde. De er betydelig mindre enn mors DNA -fragmenter. Forskjellen i størrelse gjør at cffDNA kan skilles fra mors DNA -fragmenter.

Omtrent 11 til 13,4 prosent av det cellefrie DNA i moderblod er av fosteropprinnelse. Mengden varierer mye fra en gravid kvinne til en annen. cffDNA er tilstede etter fem til syv ukers svangerskap. Mengden cffDNA øker etter hvert som graviditeten utvikler seg. Mengden cffDNA i mors blod avtar raskt etter fødsel. To timer etter levering er cffDNA ikke lenger påviselig i moderblod.

Analyse av cffDNA kan gi tidligere diagnose av fosterforhold enn nåværende teknikker. Ettersom cffDNA finnes i moderblod, har prøvetaking ingen forbundet risiko for spontan abort . cffDNA -analyse har de samme etiske og praktiske problemstillingene som andre teknikker som fostervannsprøve og korionisk prøvetaking av villus .

Noen ulemper ved prøvetaking av cffDNA inkluderer en lav konsentrasjon av cffDNA i moderblod; variasjon i mengden cffDNA mellom individer; en høy konsentrasjon av mors cellefritt DNA sammenlignet med cffDNA i moderblod.

Nye bevis viser at sviktningsgraden for cffDNA -test er høyere, fosterfraksjonen (andel av føtal versus mors DNA i mors blodprøve) er lavere og PPV for trisomier 18, 13 og SCA er redusert ved IVF -graviditeter sammenlignet med spontant unnfangelse.

Laboratoriemetoder

Det er utviklet en rekke laboratoriemetoder for cellefri foster-DNA-screening for genetiske defekter. De viktigste er (1) massivt parallell haglepistol- sekvensering (MPSS), (2) målrettet massiv parallell sekvensering (t-MPS) og (3) enkeltnukleotidpolymorfisme (SNP) -basert tilnærming.

En perifer blodprøve fra mor tas ved veneseksjon omtrent ti ukers svangerskap.

Separasjon av cffDNA

Blodplasma skilles fra mors blodprøve ved bruk av en laboratoriesentrifuge . CffDNA blir deretter isolert og renset. En standardisert protokoll for å gjøre dette ble skrevet gjennom en evaluering av den vitenskapelige litteraturen . Det høyeste utbyttet i cffDNA -ekstraksjon ble oppnådd med "QIAamp DSP Virus Kit".

Tilsetning av formaldehyd til mors blodprøver øker utbyttet av cffDNA. Formaldehyd stabiliserer intakte celler og hemmer derfor videre frigjøring av mors DNA. Med tilsetning av formaldehyd varierer prosentandelen cffDNA utvunnet fra en mors blodprøve mellom 0,32 prosent og 40 prosent med et gjennomsnitt på 7,7 prosent. Uten tilsetning av formaldehyd er gjennomsnittlig prosentandel av gjenvunnet cffDNA målt til 20,2 prosent. Andre tall varierer imidlertid mellom 5 og 96 prosent.

Gjenoppretting av cffDNA kan være relatert til lengden på DNA -fragmentene. En annen måte å øke fosterets DNA er basert på fysisk lengde på DNA -fragmenter. Mindre fragmenter kan representere opptil sytti prosent av det totale cellefrie DNA i blodprøven fra mor.

Analyse av cffDNA

I sanntids PCR brukes fluorescerende sonder for å overvåke akkumulering av amplikoner . Reporterens fluorescerende signal er proporsjonalt med antall amplikoner som genereres. Den mest passende sanntids PCR -protokollen er designet i henhold til den spesifikke mutasjonen eller genotypen som skal detekteres. Punktmutasjoner analyseres med kvalitativ sanntids PCR ved bruk av allelspesifikke prober. innsetting og sletting analyseres ved doseringsmålinger ved bruk av kvantitativ sanntids -PCR.

cffDNA kan påvises ved å finne paternalt arvelige DNA -sekvenser via polymerasekjedereaksjon (PCR).

Kvantitativ sanntids PCR

kjønnsbestemmende region Y- gen (SRY) og Y-kromosom kort tandemrepetisjon "DYS14" i cffDNA fra 511 svangerskap ble analysert ved bruk av kvantitativ sanntids-PCR (RT-qPCR). I 401 av 403 graviditeter der mors blod ble tatt ved syv ukers svangerskap eller mer, ble begge DNA -segmentene funnet.

Nestet PCR

Bruken av nestet polymerasekjedereaksjon (nestet PCR) ble evaluert for å bestemme kjønn ved å påvise et Y -kromosomspesifikt signal i cffDNA fra moderplasma. Nestet PCR oppdaget 53 av 55 hannfostre. CffDNA fra plasmaet til 3 av 25 kvinner med hunnfoster inneholdt det Y-kromosomspesifikke signalet. Den følsomhet nestede PCR i dette forsøk var 96 prosent. Den spesifisiteten var 88 prosent.

Digital PCR

Mikrofluidiske enheter tillater kvantifisering av cffDNA-segmenter i mors plasma med nøyaktighet utover sanntids PCR. Punktmutasjoner , tap av heterozygositet og aneuploidi kan påvises i et enkelt PCR -trinn. Digital PCR kan skille mellom mors blodplasma og foster -DNA på en multipleks måte.

Haglepistol -sekvensering

Haglgeværs sekvensering med høy gjennomstrømning ved bruk av verktøy som Solexa eller Illumina gir omtrent 5 millioner sekvensmerker per prøve av mors serum. Aneuploide svangerskap som trisomi ble identifisert ved testing i fjortende svangerskapsuke. Fosterets hele genomkartlegging ved foreldre haplotypeanalyse ble fullført ved bruk av sekvensering av cffDNA fra mors serum. Gravide kvinner ble studert ved hjelp av en 2-plex massivt parallell mors plasma DNA-sekvensering og trisomi ble diagnostisert med z-score større enn 3. Sekvenseringen ga sensitivitet på 100 prosent, spesifisitet på 97,9 prosent, en positiv prediktiv verdi på 96,6 prosent og en negativ prediktiv verdi på 100 prosent.

Massespektrometri

Matrix-assistert laserdesorpsjon / ionisering - time-of-flight -massespektrometri (MALDI-TOF MS) sammen med enkeltbase forlengelses etter PCR tillater cffDNA påvisning med enkelt base spesifisitet og enkelt DNA-molekyl følsomhet. DNA forsterkes ved PCR. Deretter er lineær forsterkning med baseforlengelsesreaksjon (med en tredje primer) designet for å annealere til området oppstrøms fra mutasjonsstedet . En eller to baser tilsettes forlengelsesprimeren for å produsere to forlengelsesprodukter fra villtype-DNA og mutant DNA. Enkeltbasisspesifisitet gir fordeler fremfor hybridiseringsbaserte teknikker ved bruk av TaqMan- hydrolysesonder. Ved vurdering av teknikken ble det ikke funnet falske positive eller negative ting når vi lette etter cffDNA for å bestemme fosterkjønn i seksten morsplasmaprøver. Kjønnet til nitti mannlige fostre ble korrekt oppdaget ved bruk av MALDI-TOF massespektrometri. Teknikken hadde nøyaktighet, sensitivitet og spesifisitet på over 99 prosent.

Epigenetiske modifikasjoner

Forskjeller i genaktivering mellom mors og fosterets DNA kan utnyttes. Epigenetiske modifikasjoner (arvelige modifikasjoner som endrer genfunksjon uten å endre DNA -sekvens) kan brukes til å påvise cffDNA. Den hypermetylerte RASSF1 A -promotoren er en universell fostermarkør som brukes til å bekrefte tilstedeværelsen av cffDNA. En teknikk ble beskrevet der cffDNA ble ekstrahert fra moderplasma og deretter fordøyd med metyleringssensitive og ufølsomme restriksjonsenzymer . Deretter ble PCR-analyse i sanntid av RASSF1A, SRY og DYS14 utført. Prosedyren oppdaget 79 av 90 (88 prosent) mors blodprøver der hypermetylert RASSF1A var tilstede.

mRNA

mRNA -transkripsjoner fra gener uttrykt i morkaken kan påvises i moderplasma. I denne prosedyren sentrifugeres plasma slik at et vandig lag vises. Dette laget overføres og fra det ekstraheres RNA . RT-PCR brukes til å detektere et valgt uttrykk for RNA. For eksempel er humant placentalaktogen (hPL) og beta-hCG- mRNA stabilt i mors plasma og kan påvises. (Ng et al. 2002). Dette kan bidra til å bekrefte tilstedeværelsen av cffDNA i mors plasma.

applikasjoner

Prenatal kjønnsevne

Analysen av cffDNA fra en prøve av mors plasma muliggjør prenatal kjønnsdømming . Søknader om prenatal kjønnsdømming inkluderer:

  • Sykdomstesting : Hvorvidt fostrets kjønn er mann eller kvinne, gjør det mulig å bestemme risikoen for en bestemt X-koblet recessiv genetisk lidelse i en bestemt graviditet, spesielt der moren er en genetisk bærer av lidelsen.
  • Forberedelse , for eventuelle kjønnsavhengige aspekter ved foreldre.
  • Kjønnsvalg , som etter preimplantasjon kan genetisk diagnose utføres ved bare å velge embryoer av det foretrukne kjønn, eller etter metoder etter implantasjon ved å utføre kjønnsselektiv abort avhengig av testresultat og personlige preferanser.

Sammenlignet med obstetrisk ultralyd som er upålitelig for kjønnsbestemmelse i første trimester og fostervannsprøve som har liten risiko for spontanabort , er prøvetaking av mors plasma for analyse av cffDNA uten risiko. Hovedmålene i cffDNA-analysen er genet som er ansvarlig for det kjønnsbestemmende Y-proteinet (SRY) på Y-kromosomet og DYS14-sekvensen.

Medfødt adrenal hyperplasi

Ved medfødt adrenal hyperplasi mangler binyrebarken passende kortikosteroid -syntese, noe som fører til overflødig adrenal androgener og påvirker kvinnelige fostre. Det er en ekstern maskulinisering av kjønnsorganene hos hunnfostrene. Mødre til utsatte fostre får deksametason ved 6 ukers svangerskap for å undertrykke frigjøring av androgener i hypofysen .

Hvis analyse av cffDNA hentet fra en prøve av mors plasma mangler genetiske markører som bare finnes på Y -kromosomet, tyder det på et kvinnelig foster. Imidlertid kan det også indikere feil i selve analysen (et falskt negativt resultat). Faderlige genetiske polymorfismer og kjønnsuavhengige markører kan brukes til å påvise cffDNA. En høy grad av heterozygositet av disse markørene må være tilstede for denne applikasjonen.

Faderskapstesting

Prenatal DNA -farskapstesting er kommersielt tilgjengelig. Testen kan utføres ved ni ukers svangerskap.

Enkeltgenforstyrrelser

Autosomalt dominerende og recessive enkeltgenforstyrrelser som har blitt diagnostisert prenatalt ved analyse av paternalt arvet DNA inkluderer cystisk fibrose , beta -thalassemi , sigdcelleanemi , spinal muskelatrofi og myotonisk dystrofi . Prenatal diagnose av enkeltgenforstyrrelser som skyldes en autosomal recessiv mutasjon, en maternelt arvet autosomal dominant mutasjon eller store sekvensmutasjoner som inkluderer duplisering, ekspansjon eller innsetting av DNA -sekvenser er vanskeligere.

I cffDNA er fragmenter på 200 - 300 bp lengde involvert i enkeltgenforstyrrelser vanskeligere å oppdage.

For eksempel er den autosomale dominerende tilstanden, achondroplasi forårsaket av FGFR3 genpunktsmutasjon. I to graviditeter med et foster med achondroplasi ble det funnet en paternalt arvet G1138A -mutasjon fra cffDNA fra en mors plasmaprøve i den ene og en G1138A de novo -mutasjon fra den andre.

I studier av genetikken til Huntingtons chorea ved bruk av qRT-PCR av cffDNA fra mors plasmaprøver, har CAG-gjentakelser blitt påvist på normale nivåer (17, 20 og 24).

cffDNA kan også brukes til å diagnostisere enkeltgenforstyrrelser . Utvikling i laboratorieprosesser ved bruk av cffDNA kan tillate prenatal diagnose av aneuploidier som trisomi 21 (Downs syndrom) hos fosteret.

Hemolytisk sykdom hos foster og nyfødte

Inkompatibilitet av foster- og mors RhD -antigener er hovedårsaken til hemolytisk sykdom hos det nyfødte . Omtrent 15 prosent av kaukasiske kvinner, 3 til 5 prosent av svarte Afrika -kvinner og mindre enn 3 prosent av asiatiske kvinner er RhD -negative.

Nøyaktig prenatal diagnose er viktig fordi sykdommen kan være dødelig for den nyfødte og fordi behandling inkludert intramuskulært immunglobulin (Anti-D) eller intravenøst immunglobulin kan administreres til mødre i fare.

PCR for å påvise RHD (gen) gen ekson 5 og 7 fra cffDNA erholdt fra moder plasma mellom 9 og 13 ukers graviditet gir en høy grad av spesifisitet, sensitivitet og diagnostisk nøyaktighet (> 90 prosent) når sammenlignet med RhD bestemmelse fra nyfødt ledningen blodserum . Lignende resultater ble oppnådd med mål om ekson 7 og 10. Dråpe digital PCR i føtal RhD-bestemmelse var sammenlignbar med en rutinemessig sanntid PCR-teknikk.

Rutinemessig bestemmelse av fosterets RhD-status fra cffDNA i mors serum tillater tidlig behandling av gravide i fare, samtidig som unødvendig bruk av Anti-D reduseres med over 25 prosent.

Aneuploidi

Kjønnskromosomer

Analyse av morserumet cffDNA ved high-throughput-sekvensering kan oppdage vanlige føtale kjønn kromosom aneuploidies som Turners syndrom , Klinefelters syndrom og trippel X syndrom , men fremgangsmåten er positive prediktive verdi er lav.

Trisomi 21

Fetaltrisomi av kromosom 21 er årsaken til Downs syndrom. Denne trisomien kan påvises ved analyse av cffDNA fra moderblod ved massiv parallell haglepistolsekvensering (MPSS). En annen teknikk er digital analyse av utvalgte regioner (DANSR). Slike tester viser en sensitivitet på omtrent 99% og en spesifisitet på mer enn 99,9%. Derfor kan de ikke betraktes som diagnostiske prosedyrer, men kan brukes til å bekrefte en positiv mors screeningstest, for eksempel screening i første trimester eller ultralydmarkører for tilstanden.

Trisomi 13 og 18

Analyse av cffDNA fra moderplasma med MPSS på jakt etter trisomi 13 eller 18 er mulig

Faktorer som begrenser sensitivitet og spesifisitet inkluderer nivåene av cffDNA i moderplasmaet; mors kromosomer kan ha mosaikk .

En rekke fetale nukleinsyremolekyler avledet fra aneuploide kromosomer kan påvises, inkludert SERPINEB2 mRNA, kledd B, hypometylert SERPINB5 fra kromosom 18, placenta-spesifikk 4 (PLAC4), hypermetylert holokarboksylasesyntetase (HLCS) og c21orf105 mRNA fra kromosom 12. Med trisomi, er mRNA -allelene i mors plasma ikke det normale 1: 1 -forholdet, men er faktisk 2: 1. Allelleforhold bestemt av epigenetiske markører kan også brukes til å oppdage de komplette trisomiene. Massiv parallell sekvensering og digital PCR for fosteraneuploidideteksjon kan brukes uten begrensning til fosterspesifikke nukleinsyremolekyler. (MPSS) anslås å ha en sensitivitet på mellom 96 og 100%, og en spesifisitet mellom 94 og 100% for å oppdage Downs syndrom. Det kan utføres ved 10 ukers svangerskapsalder . En studie i USA estimerte en falsk positiv rate på 0,3% og en positiv prediktiv verdi på 80% ved bruk av cffDNA for å oppdage Downs syndrom.

Preeklampsi

Preeklampsi er en kompleks tilstand av graviditet som involverer hypertensjon og proteinuri vanligvis etter 20 ukers svangerskap. Det er assosiert med dårlig cytotrofoblastisk invasjon av myometrium . Tilstanden begynner mellom 20 og 34 ukers svangerskap, regnes som "tidlig". Mammas plasmaprøver ved graviditet komplisert av preeklampsi har betydelig høyere nivåer av cffDNA enn de som er i normale graviditeter. Dette gjelder for tidlig utbrudd av preeklampsi.

Fremtidsperspektiver

Ny generasjons sekvensering kan brukes til å gi en hel genom -sekvens fra cffDNA. Dette reiser etiske spørsmål. Imidlertid kan nytten av prosedyren øke etter hvert som det oppdages klare assosiasjoner mellom spesifikke genetiske varianter og sykdomstilstander.

Se også

Referanser