Døgnklokke - Circadian clock
En døgnklokke , eller døgnoscillator , er en biokjemisk oscillator som sykler med en stabil fase og er synkronisert med soltid .
En slik klocks in vivo -periode er nødvendigvis nesten nøyaktig 24 timer (jordens nåværende soldag ). I de fleste levende ting gjør internt synkroniserte døgnklokker det mulig for organismen å forutse daglige miljøendringer som tilsvarer dag -natt -syklusen og justere dens biologi og oppførsel deretter.
Begrepet døgnrytme stammer fra det latinske circa (omtrent) dør (en dag), siden når det tas fra eksterne signaler (for eksempel miljølys), går det ikke til nøyaktig 24 timer. Klokker hos mennesker i et laboratorium i konstant svakt lys vil for eksempel gjennomsnittlig være omtrent 24,2 timer per dag, i stedet for 24 timer nøyaktig.
Den normale kroppsklokken svinger med en endogen periode på nøyaktig 24 timer, den får med seg når den mottar tilstrekkelige daglige korrigerende signaler fra miljøet, først og fremst dagslys og mørke. Døgnklokker er de sentrale mekanismene som driver døgnrytmer . De består av tre hovedkomponenter:
- en sentral biokjemisk oscillator med en periode på omtrent 24 timer som holder tid;
- en rekke inngangsstier til denne sentrale oscillatoren for å tillate medføring av klokken;
- en serie utgangsveier knyttet til forskjellige faser av oscillatoren som regulerer åpenbare rytmer i biokjemi, fysiologi og atferd gjennom en organisme.
Klokken tilbakestilles når en organisme registrerer miljømessige tidstegn, der den primære er lys. Sirkadiske oscillatorer er allestedsnærværende i vev i kroppen hvor de synkroniseres av både endogene og eksterne signaler for å regulere transkripsjonell aktivitet gjennom dagen på en vevsspesifikk måte. Døgnklokken er sammenflettet med de fleste cellulære metabolske prosesser, og den påvirkes av organismenes aldring. De grunnleggende molekylære mekanismene til den biologiske klokken er definert hos virveldyrarter , Drosophila melanogaster , planter , sopp , bakterier og antagelig også i Archaea .
I 2017 ble Nobelprisen i fysiologi eller medisin tildelt Jeffrey C. Hall , Michael Rosbash og Michael W. Young "for deres funn av molekylære mekanismer som styrer døgnrytmen" i fruktfluer.
Vertebrat anatomi
Hos virveldyr er hoveddøgneklokken inne i den suprachiasmatiske kjernen (SCN), en bilateral nerveklynge på rundt 20 000 nevroner. Selve SCN ligger i hypothalamus , et lite område av hjernen som ligger rett over optisk chiasme , hvor det mottar innspill fra spesialiserte lysfølsomme ganglionceller i netthinnen via retinohypothalamus .
SCN opprettholder kontroll over kroppen ved å synkronisere "slaveoscillatorer", som viser sine egne nesten 24-timers rytmer og kontrollerer døgnfenomener i lokalt vev. Gjennom intercellulære signalmekanismer som vasoaktivt tarmpeptid , signaliserer SCN andre hypotalamiske kjerner og pinealkjertelen til å modulere kroppstemperatur og produksjon av hormoner som kortisol og melatonin ; disse hormonene kommer inn i sirkulasjonssystemet , og induserer klokkedrevne effekter i hele organismen.
Det er imidlertid ikke klart nøyaktig hvilket signal (eller signaler) som utfører hovedopplæring til de mange biokjemiske klokkene som finnes i vev i hele kroppen. Se avsnittet "regulering av døgnoscillatorer" nedenfor for mer informasjon.
Transkripsjonell og ikke-transkripsjonell kontroll
Bevis for et genetisk grunnlag for døgnrytmer i høyere eukaryoter begynte med oppdagelsen av perioden ( per ) locus i Drosophila melanogaster fra fremadrettede genetiske skjermer fullført av Ron Konopka og Seymour Benzer i 1971. Gjennom analysen av per døgnmutanter og ytterligere mutasjoner på Drosophila -klokkegener, en modell som omfatter positive og negative autoregulatoriske tilbakemeldingssløyfer for transkripsjon og oversettelse, har blitt foreslått. Kjerne døgnrytme 'klokke' gener er definert som gener hvis proteinprodukter er nødvendige komponenter for generering og regulering av døgnrytmer. Lignende modeller har blitt foreslått hos pattedyr og andre organismer.
Studier av cyanobakterier endret imidlertid vårt syn på klokkemekanismen, siden det ble funnet av Kondo og kolleger at disse encellede organismer kunne opprettholde nøyaktig 24-timers timing i fravær av transkripsjon, det vil si at det ikke var krav om transkripsjon- oversettelse autoregulatorisk tilbakemeldingssløyfe for rytmer. Videre ble denne klokken rekonstruert i et reagensrør (dvs. i fravær av cellecomponenter), som beviser at nøyaktige 24-timers klokker kan dannes uten behov for genetiske tilbakemeldingskretser. Imidlertid var denne mekanismen bare gjeldende for cyanobakterier og ikke generisk.
I 2011 kom et stort gjennombrudd i forståelsen fra Reddy -laboratoriet ved University of Cambridge . Denne gruppen oppdaget døgnrytmer i redoksproteiner ( peroksiredoksiner ) i celler som manglet en kjerne - menneskelige røde blodlegemer. I disse cellene var det ingen transkripsjon eller genetiske kretser, og derfor ingen tilbakemeldingssløyfe. Lignende observasjoner ble gjort i en marin alge og deretter i musens røde blodlegemer. Enda viktigere er at redoksoscillasjoner som demonstrert av peroksiredoksinrytmer nå har blitt sett i flere fjerne riker av livet (eukaryoter, bakterier og archaea), som dekker det evolusjonære treet. Derfor ser redoksklokker ut til å være bestefarsklokken , og genetisk tilbakemelding kretser de viktigste utgangsmekanismene for å kontrollere celle- og vevsfysiologi og atferd.
Derfor må klokkemodellen betraktes som et produkt av et samspill mellom både transkripsjonelle kretser og ikke-transkripsjonelle elementer som redoksoscillasjoner og proteinfosforyleringssykluser.
Pattedyr klokker
Selektiv gennedslagning av kjente komponenter i den menneskelige døgnklokken viser at både aktive kompenserende mekanismer og redundans brukes for å opprettholde klokkens funksjon. Hvordan disse selvbærende mobilklokkene oppnår multicellulær integrasjon er stort sett uklart, men astrocytter alene kan drive de molekylære svingningene i SCN og døgnadferd hos mus.
Flere pattedyrklokkegener er identifisert og karakterisert gjennom eksperimenter på dyr som inneholder naturlig forekommende, kjemisk induserte og målrettede knockout -mutasjoner, og forskjellige sammenlignende genomiske tilnærminger. Flertallet av identifiserte klokkekomponenter er transkripsjonelle aktivatorer eller repressorer som modulerer proteinstabilitet og kjernefysisk translokasjon, og lager to sammenkoblede tilbakemeldingssløyfer. I den primære tilbakemeldingssløyfen heterodimeriserer medlemmer av den grunnleggende helix-loop-helix (bHLH) -PAS (Period-Arnt-Single-minded) transkripsjonsfaktorfamilien, CLOCK og BMAL1 , i cytoplasma for å danne et kompleks som, etter translokasjon til kjernen, starter transkripsjon av målgener som kjerneurgenenes periodeperioder ( PER1 , PER2 og PER3 ) og to kryptokromgener ( CRY1 og CRY2 ). Negativ tilbakemelding oppnås av PER: CRY heterodimerer som translokerer tilbake til kjernen for å undertrykke sin egen transkripsjon ved å hemme aktiviteten til CLOCK: BMAL1 -kompleksene. En annen reguleringssløyfe induseres når CLOCK: BMAL1 heterodimere aktiverer transkripsjonen av Rev-ErbA og Rora, to retinsyre-relaterte foreldreløse kjernefysiske reseptorer. REV-ERBa og RORa konkurrerer deretter om å binde retinsyre-relaterte foreldreløse reseptorresponselementer (RORE) som er tilstede i Bmal1-promotoren. Gjennom påfølgende binding av RORE kan medlemmer av ROR og REV-ERB regulere Bmal1 . Mens ROR aktiverer transkripsjon av Bmal1 , undertrykker REV-ERB den samme transkripsjonsprosessen. Derfor er sirkadisk svingning av Bmal1 både positivt og negativt regulert av ROR og REV-ERB.
Insektklokker
I D. melanogaster er gensyklusen (CYC) ortologen til BMAL1 hos pattedyr. Dermed aktiverer CLOCK - CYC dimerer transkripsjonen av døgngener. Genet tidløst (TIM) er ortologen for CRY -pattedyr som inhibitor; D. melanogaster CRY fungerer i stedet som en fotoreceptor. I fluer bindes CLK – CYC til promotorene av døgnregulerte gener bare på transkripsjonstidspunktet. En stabiliserende sløyfe eksisterer også der genet vrille (VRI) hemmer mens PAR-domene protein-1 (PDP1) aktiverer klokke transkripsjon.
Soppklokker
I filamentøs sopp N. crassa er klokkemekanismen analog, men ikke-ortologisk, til pattedyr og fluer.
Planteklokker
Døgnklokken i planter har helt andre komponenter enn de i dyret, sopp eller bakterielle klokker. Planteklokken har en konseptuell likhet med dyreklokken ved at den består av en rekke sammenlåsende transkripsjonelle tilbakemeldingssløyfer. Genene som er involvert i klokken viser sitt topputtrykk på et bestemt tidspunkt på dagen. De første genene som ble identifisert i planteklokken var TOC1 , CCA1 og LHY . Topputtrykket for CCA1- og LHY -genene skjer ved daggry, og topputtrykket for TOC1 -genet skjer omtrent i skumringen. CCA1/LHY og TOC1 proteiner undertrykker uttrykk for hverandres gener. Resultatet er at ettersom CCA1/LHY -proteinnivåene begynner å redusere etter daggry, frigjør det undertrykkelsen på TOC1 -genet, slik at TOC1 -ekspresjon og TOC1 -proteinnivåer kan øke. Etter hvert som TOC1 -proteinnivået øker, undertrykker det ytterligere ekspresjonen av CCA1- og LHY -genene. Det motsatte av denne sekvensen skjer over natten for å gjenopprette topputtrykket for CCA1- og LHY-gener ved daggry. Det er mye mer komplisert bygget inn i klokken, med flere løkker som involverer PRR gener, Evening-komplekset og de lysfølsomme GIGANTIA og ZEITLUPE proteiner.
Bakterielle klokker
I bakterielle døgnrytmer ble svingningene av fosforyleringen av cyanobakterielt Kai C -protein rekonstituert i et cellefritt system (en in vitro -klokke ) ved å inkubere KaiC med KaiA , KaiB og ATP .
Etter transkripsjonell endring
I lang tid ble det antatt at transkripsjonelle aktiverings-/undertrykkingssykluser drevet av transkripsjonelle regulatorer som utgjør døgnklokken var den viktigste drivkraften for døgngenuttrykk hos pattedyr. Mer nylig ble det imidlertid rapportert at bare 22% av messenger -RNA -sykkelgenene er drevet av de novo -transkripsjon. Post-transkripsjonelle mekanismer på RNA-nivå som driver rytmisk proteinuttrykk ble senere rapportert, for eksempel mRNA-polyadenyleringsdynamikk.
Fustin og medarbeidere identifiserte metylering av interne adenosiner (m 6 A) i mRNA (særlig klokkeutskrifter selv) som en sentral regulator for døgnperioden. Inhibering av m 6 A-metylering via farmakologisk inhibering av cellulære metyleringer eller nærmere bestemt ved siRNA-mediert demping av m 6 A-metylase Mettl3 førte til en dramatisk forlengelse av døgnperioden . Derimot førte overuttrykk av Mettl3 in vitro til en kortere periode. Disse observasjonene demonstrerte tydelig viktigheten av RNA-nivå post-transkripsjonell regulering av døgnklokken, og etablerte samtidig den fysiologiske rollen til (m 6 A) RNA-metylering.
Post-translasjonell modifikasjon
De autoregulatoriske tilbakemeldingsløyfene i klokker tar omtrent 24 timer å fullføre en syklus og utgjør en sirkadisk molekylær klokke. Denne generasjonen av ~ 24-timers molekylær klokke styres av posttranslasjonelle modifikasjoner som fosforylering , sumoylering , histonacetylering og metylering og ubiquitinering . Reversibel fosforylering regulerer viktige prosesser som kjernefysisk inntreden, dannelse av proteinkomplekser og proteinnedbrytning. Hver av disse prosessene bidrar betydelig til å holde perioden på ~ 24 timer og gir presisjonen til en døgnklokke ved å påvirke stabiliteten til de nevnte kjerneurproteinene. Selv om transkripsjonsregulering genererer rytmiske RNA -nivåer, kontrollerer regulerte posttranslasjonelle modifikasjoner proteinoverflod, subcellulær lokalisering og repressoraktivitet for PER og CRY.
Proteiner som er ansvarlige for posttranslasjonell modifikasjon av klokkegener inkluderer kaseinkinase- familiemedlemmer (kaseinkinase 1-delta (CSNK1D) og kaseinkinase 1 epsilon (CSNK1E) og F-boks leucinrikt gjentatt protein 3 (FBXL3). Hos pattedyr, CSNK1E og CSNK1D er kritiske faktorer som regulerer kjernedøgnets proteinomsetning. Eksperimentell manipulasjon på et av disse proteinene resulterer i dramatiske effekter på døgnperioder, for eksempel endrede kinaseaktiviteter og forårsaker kortere døgnperioder, og viser videre viktigheten av posttranslasjonell regulering innenfor kjernemekanismen til døgnklokken. Disse mutasjonene har blitt av særlig interesse for mennesker ettersom de er implisert i den avanserte søvnfaseforstyrrelsen.En liten ubiquitinrelatert modifikatorproteinmodifikasjon av BMAL1 har også blitt foreslått som et annet nivå av posttranslasjonell regulering.
Regulering av døgnoscillatorer
Sirkadiske oscillatorer er ganske enkelt oscillatorer med en periode på omtrent 24 timer. Som svar på lysstimulering korresponderer kroppen med et system og nettverk av veier som jobber sammen for å bestemme den biologiske dagen og natten. De regulatoriske nettverkene er involvert i å holde klokken presis over en rekke reguleringsmekanismer etter oversettelse. Sirkadiske oscillatorer kan reguleres ved fosforylering , SUMOylering, ubiquitination og histonacetylering og deacetylering , den kovalente modifikasjonen av histonhalen som styrer nivået av kromatinstrukturer som får genet til å uttrykkes lettere. Metylering av en proteinstruktur legger til en metylgruppe og regulerer proteinfunksjonen eller genuttrykket, og i histonmetylering blir genuttrykk enten undertrykt eller aktivert gjennom endring av DNA -sekvensen. Histoner gjennomgår en acetylerings-, metylerings- og fosforyleringsprosess, men de store strukturelle og kjemiske endringene skjer når enzymer histonacetyltransferaser (HAT) og histondeacetylaser (HDAC) tilfører eller fjerner acetylgrupper fra histonen og forårsaker en stor endring i DNA -uttrykk. Ved å endre DNA -uttrykk, regulerer histonacetylering og metylering hvordan døgnoscillatoren fungerer. Fustin og medarbeidere ga et nytt kompleks kompleksitet til reguleringen av døgnoscillatoren hos pattedyr ved å vise at RNA-metylering var nødvendig for effektiv eksport av modent mRNA ut av kjernen: inhibering av RNA-metylering forårsaket kjernefysisk retensjon av klokkegenutskrifter, noe som førte til til en lengre døgnperiode.
Et sentralt trekk ved klokker er deres evne til å synkronisere med eksterne stimuli. Tilstedeværelsen av celleautonome oscillatorer i nesten hver celle i kroppen reiser spørsmålet om hvordan disse oscillatorene er tidsmessig koordinert. Jakten på universelle tidspunkter for perifere klokker hos pattedyr har gitt hovedopplæringssignaler som fôring, temperatur og oksygen. Både fôringsrytmer og temperatursykluser ble vist å synkronisere perifere klokker og til og med koble dem fra hovedklokken i hjernen (f.eks. Begrenset fôring på dagtid). Nylig ble oksygenrytmer funnet å synkronisere klokker i dyrkede celler.
Systembiologi nærmer seg for å belyse oscillerende mekanismer
Moderne eksperimentelle tilnærminger ved bruk av systembiologi har identifisert mange nye komponenter i biologiske klokker som antyder et integrert syn på hvordan organismer opprettholder døgnets svingning.
Nylig har Baggs et al. utviklet en ny strategi kalt "Gene Dosage Network Analysis" (GDNA) for å beskrive nettverksfunksjoner i den menneskelige døgnklokken som bidrar til en organismes robusthet mot genetiske forstyrrelser. I studien brukte forfatterne små interfererende RNA (siRNA) for å indusere doseavhengige endringer i genuttrykk av klokkekomponenter i udødeliggjorte humane osteosarkom U2OS-celler for å bygge genforeningsnettverk som er i samsvar med kjente biokjemiske begrensninger i døgnklokken hos pattedyr. Ved å bruke flere doser siRNA drev deres kvantitative PCR for å avdekke flere nettverksfunksjoner i døgnklokken, inkludert proporsjonale responser av genuttrykk, signalutbredelse gjennom samhandlende moduler og kompensasjon gjennom genuttrykkendringer.
Proporsjonelle responser i genuttrykk nedstrøms etter siRNA-indusert forstyrrelse avslørte ekspresjonsnivåer som ble aktivt endret med hensyn til genet som ble slått ned. For eksempel, da Bmal1 ble slått ned på en doseavhengig måte, viste det seg at Rev-ErbA alfa- og Rev-ErbA beta- mRNA-nivåer gikk ned på en lineær, proporsjonal måte. Dette støttet tidligere funn om at Bmal1 direkte aktiverer Rev-erb-gener og foreslår videre Bmal1 som en sterk bidragsyter til Rev-erb-uttrykk.
I tillegg ga GDNA -metoden et rammeverk for å studere biologiske relemekanismer i døgnnettverk der moduler kommuniserer endringer i genuttrykk. Forfatterne observerte signalutbredelse gjennom interaksjoner mellom aktivatorer og repressorer, og avdekket enveis paralogkompensasjon blant flere klokkegenrepressorer-for eksempel når PER1 er oppbrukt, er det en økning i Rev-erbs, som igjen forplanter et signal for å redusere uttrykk i BMAL1 , målet for Rev-erb-repressorene.
Ved å undersøke knockdown av flere transkripsjonelle repressorer, avslørte GDNA også paralogkompensasjon der genparaloger ble oppregulert gjennom en aktiv mekanisme der genfunksjonen erstattes etter knockdown på en ikke -redunant måte - det vil si at en komponent er tilstrekkelig for å opprettholde funksjonen. Disse resultatene antydet videre at et klokkenettverk bruker aktive kompenserende mekanismer i stedet for enkel redundans for å gi robusthet og opprettholde funksjon. I hovedsak foreslo forfatterne at de observerte nettverksfunksjonene fungerer sammen som et genetisk buffersystem for å opprettholde klokkefunksjon i møte med genetisk og miljømessig forstyrrelse. Etter denne logikken kan vi bruke genomikk for å utforske nettverksfunksjoner i døgnoscillatoren.
En annen studie utført av Zhang et al. også ansatt en genomomfattende liten interfererende RNA- skjerm i U2OS-cellelinje for å identifisere ytterligere klokkegener og modifikatorer ved bruk av luciferase-reportergenuttrykk. Knockdown av nesten 1000 gener reduserte rytmeamplituden. Forfatterne fant og bekreftet på flere hundre potente effekter på periode lengde eller økes i amplitude sekundære skjermer. Karakterisering av en delmengde av disse genene viste en doseavhengig effekt på oscillatorfunksjonen . Proteininteraksjonsnettverksanalyse viste at dusinvis av genprodukter direkte eller indirekte assosierer med kjente klokkekomponenter. Pathway -analyse avslørte at disse genene er overrepresentert for komponenter i insulin og pinnsvinssignalvei , cellesyklusen og folatmetabolismen. Sammen med data som viser at mange av disse veiene er klokkeregulert, sier Zhang et al. postulert at klokken er sammenkoblet med mange aspekter av mobilfunksjonen.
En systembiologisk tilnærming kan relatere døgnrytmen til cellulære fenomener som opprinnelig ikke ble betraktet som regulatorer for døgnets svingning. For eksempel vurderte en workshop i 2014 ved NHLBI nyere sirkadiske genomiske funn og diskuterte grensesnittet mellom kroppsklokken og mange forskjellige mobilprosesser.
Variasjon i døgnklokker
Selv om en presis 24-timers døgnklokke finnes i mange organismer, er den ikke universell. Organismer som lever i det høye arktiske eller høye antarktis opplever ikke soltid i alle årstider, selv om de fleste antas å opprettholde en døgnrytme nær 24 timer, for eksempel bjørner under torpor. Mye av jordens biomasse befinner seg i den mørke biosfære, og selv om disse organismene kan utvise rytmisk fysiologi, er det neppe sannsynlig at den dominerende rytmen for disse organismene er døgnrytme. For øst-vest trekkende organismer-og spesielt de organismer som omgår kloden-kan den absolutte 24-timers fasen avvike over måneder, årstider eller år.
Noen edderkopper viser uvanlig lange eller korte døgnklokker. Noen søppelbanebrytere har for eksempel 18,5-timers døgnklokker, men er fortsatt i stand til å delta i en 24-timers syklus. Denne tilpasningen kan hjelpe edderkoppene med å unngå rovdyr ved å la dem være mest aktive før soloppgang. Svarte enkers klokker er arytmiske, kanskje på grunn av deres preferanse for mørke omgivelser.