Gram flekk - Gram stain
Gramfarging eller Gramfarging , også kalt Grams metode , er en flekkemetode som brukes til å skille og klassifisere bakteriearter i to store grupper: grampositive bakterier og gramnegative bakterier . Navnet kommer fra den danske bakteriologen Hans Christian Gram , som utviklet teknikken.
Gramfarging skiller bakterier etter de kjemiske og fysiske egenskapene til celleveggene . Gram-positive celler har et tykt lag av peptidoglykan i celleveggen som beholder den primære flekken, krystallfiolett . Gram-negative celler har et tynnere peptidoglykanlag som lar krystallfiolett skylle ut ved tilsetning av etanol. De er farget rosa eller rød av motfarge , vanligvis safranin eller Fuchsine . Lugols jodoppløsning tilsettes alltid etter tilsetning av krystallfiolett for å styrke flekkens bindinger med cellemembranen. Gramfarging er nesten alltid det første trinnet i den foreløpige identifiseringen av en bakteriell organisme. Selv om Gramfarging er et verdifullt diagnostisk verktøy i både kliniske og forskningsinnstillinger, kan ikke alle bakterier definitivt klassifiseres etter denne teknikken. Dette gir opphav til gram-variable og gram-ubestemte grupper.
Historie
Metoden er oppkalt etter oppfinneren, den danske forskeren Hans Christian Gram (1853–1938), som utviklet teknikken mens han jobbet med Carl Friedländer på likhuset på bysykehuset i Berlin i 1884. Gram utviklet teknikken sin ikke med det formål skille en type bakterier fra en annen, men for å gjøre bakterier mer synlige i flekkete deler av lungevev. Han publiserte sin metode i 1884, og inngår i sin korte rapport observasjonen at tyfus bacillus ikke beholde flekken.
Bruker
Gramfarging er en bakteriologisk laboratorieteknikk som brukes til å differensiere bakteriearter i to store grupper ( gram-positive og gram-negative ) basert på de fysiske egenskapene til celleveggene . Gramfarging brukes ikke for å klassifisere archaea , tidligere archaeabacteria, siden disse mikroorganismer gir vidt varierende responser som ikke følger deres fylogenetiske grupper .
Noen organismer er gram-variable (noe som betyr at de kan flekke enten negativt eller positivt); noen er ikke farget med fargestoff som brukes i Gram -teknikken og blir ikke sett. I et moderne miljø- eller molekylær mikrobiologilaboratorium utføres mest identifisering ved hjelp av genetiske sekvenser og andre molekylære teknikker, som er langt mer spesifikke og informative enn differensialfarging.
Medisinsk
Gramflekker utføres på kroppsvæske eller biopsi ved mistanke om infeksjon . Gramflekker gir resultater mye raskere enn dyrking , og er spesielt viktige når infeksjon ville gjøre en viktig forskjell i pasientens behandling og prognose; eksempler er cerebrospinalvæske for hjernehinnebetennelse og ledvæske for septisk artritt .
Fargemekanisme
Gram-positive bakterier har en tykk maske-lignende cellevegg laget av peptidoglykan (50–90% av cellehylsteret), og blir som et resultat farget lilla av krystallfiolett, mens gramnegative bakterier har et tynnere lag (10% av cellen konvolutt), så ikke behold den lilla flekken og er rosa mot safranin. Det er fire grunnleggende trinn i Gram -flekken:
- Påføring av en primær flekk ( krystallfiolett ) på et varmefiksert utstryk av en bakteriekultur. Varmefiksering dreper noen bakterier, men brukes hovedsakelig til å feste bakteriene på lysbildet slik at de ikke skylles ut under fargingsprosedyren.
- Tilsetningen av jod , som binder seg til krystallfiolett og fanger det i cellen
- Rask avfarging med etanol eller aceton
- Motfarging med safranin . Carbol fuchsin er noen ganger erstattet av safranin siden det mer intenst flekker anaerobe bakterier, men det er mindre vanlig som motfare.
| Bruk av | Reagens | Cellefarge | |||
|---|---|---|---|---|---|
| Gram-positiv | Gram-negativ | ||||
| Primærfargestoff | krystallfiolett | lilla | lilla | ||
| mordant | jod | lilla | lilla | ||
| Avfarging | alkohol / aceton | lilla | fargeløs | ||
| Motflekk | safranin / carbol fuchsin | lilla | rosa eller rødt | ||
Krystallfiolett (CV) dissosierer i vandige løsninger til CV+
og klorid ( Cl-
) ioner. Disse ionene trenger inn i celleveggen til både grampositive og gramnegative celler. den CV+
ion interagerer med negativt ladede komponenter i bakterieceller og flekker cellene lilla.
Jodide ( jeg-
eller jeg-
3) samhandler med CV+
og danner store komplekser av krystallfiolett og jod (CV – I) i cellens indre og ytre lag. Jod blir ofte referert til som en mordant , men er et fangstmiddel som forhindrer fjerning av CV – I -komplekset og farger derfor cellen.
Når en avfarger som alkohol eller aceton tilsettes, samhandler den med lipidene i cellemembranen. En gramnegativ celle mister sin ytre lipopolysakkaridmembran, og det indre peptidoglykanlaget blir utsatt. CV-I-kompleksene vaskes fra den gramnegative cellen sammen med den ytre membranen. I kontrast blir en gram-positiv celle dehydrert fra en etanolbehandling. De store CV-I-kompleksene blir fanget i den gram-positive cellen på grunn av dens flerlags peptidoglykan. Avfargningstrinnet er kritisk og må være riktig timet. den krystallfiolette flekken fjernes fra både grampositive og negative celler hvis avfargemiddelet blir stående for lenge (i løpet av sekunder).
Etter avfarging forblir den gram-positive cellen lilla og den gramnegative cellen mister sin lilla farge. Counterstain, som vanligvis er positivt ladet safranin eller basic fuchsine, påføres sist for å gi misfargede gramnegative bakterier en rosa eller rød farge. Både grampositive bakterier og gramnegative bakterier tar opp motflekken. Motfargen er imidlertid usynlig for grampositive bakterier på grunn av den mørkere krystallfiolette flekken.
Eksempler
Gram-positive bakterier
Gram-positive bakterier har vanligvis en enkelt membran ( monoderm ) omgitt av en tykk peptidoglykan. Denne regelen etterfølges av to phyla: Firmicutes (bortsett fra klassene Mollicutes og Negativicutes ) og Actinobacteria . I kontrast er medlemmer av Chloroflexi (grønne ikke-svovelbakterier) monoderms, men har en tynn eller fraværende (klasse Dehalococcoidetes ) peptidoglycan og kan flekke negative, positive eller ubestemte; medlemmer av Deinococcus - Thermus -gruppen flekker positivt, men er didermer med en tykk peptidoglykan.
Historisk sett utgjorde de gram-positive formene phylum Firmicutes , et navn som nå brukes for den største gruppen. Den inkluderer mange kjente slekter som Lactobacillus, Bacillus , Listeria , Staphylococcus , Streptococcus , Enterococcus og Clostridium . Det har også blitt utvidet til å omfatte Mollicutes, bakterier som Mycoplasma og Thermoplasma som mangler cellevegger og derfor ikke kan farges Gram, men er avledet fra slike former.
Noen bakterier har cellevegger som er spesielt flinke til å beholde flekker. Disse vil virke positive ved Gram-flekk, selv om de ikke er nært beslektet med andre gram-positive bakterier. Disse kalles syrefaste bakterier , og kan bare differensieres fra andre grampositive bakterier ved spesielle fargingsprosedyrer .
Gram-negative bakterier
Gram-negative bakterier har generelt et tynt lag peptidoglykan mellom to membraner ( diderm ). Lipopolysakkarid (LPS) er det mest utbredte antigenet på celleoverflaten til de fleste gramnegative bakterier, og bidrar med opptil 80% av den ytre membranen til E. coli og Salmonella . De fleste bakterielle phyla er gramnegative, inkludert cyanobakterier , grønne svovelbakterier og de fleste Proteobacteria (unntak er noen medlemmer av Rickettsiales og insekt-endosymbionter av Enterobacteriales ).
Gramvariable og Gram-ubestemte bakterier
Noen bakterier, etter farging med Gram-flekken, gir et gram-variabelt mønster: en blanding av rosa og lilla celler ses. I kulturer av Bacillus, Butyrivibrio og Clostridium sammenfaller en nedgang i peptidoglycan tykkelse under vekst med en økning i antall celler som flekker gram-negative. I tillegg kan alder av kulturen påvirke resultatene av flekken i alle bakterier som er farget ved bruk av Gram -flekken.
Gram-ubestemte bakterier reagerer ikke forutsigbart på Gram-farging og kan derfor ikke bestemmes som enten gram-positive eller gram-negative. Eksempler inkluderer mange arter av Mycobacterium , inkludert Mycobacterium bovis , Mycobactrium leprae og Mycobacterium tuberculosis , hvorav de to sistnevnte er årsakene til henholdsvis spedalskhet og tuberkulose. Bakterier av slekten Mycoplasma mangler en cellevegg rundt cellemembranene , noe som betyr at de ikke flekker etter Grams metode og er motstandsdyktige mot antibiotika som er målrettet mot celleveggsyntese.
Ortografisk notat
Begrepet Gramfarging stammer fra etternavnet til Hans Christian Gram ; den benevnelse (Gram) blir derfor aktivert, men ikke den felles substantiv (flekk) som er vanlig for vitenskapelige betegnelser. De første bokstavene i gram-positive og gram-negative , som er eponymous adjektiv , kan enten være store G eller små g , avhengig av hvilken stilguide (hvis noen) som styrer dokumentet som skrives. Små bokstaver brukes av de amerikanske sentrene for sykdomskontroll og forebygging og andre stilregimer som AMA -stilen . Ordbøker kan bruke små, store bokstaver eller begge deler. Gram-positiv eller gramnegativ bruk av store bokstaver er også vanlig i mange vitenskapelige tidsskriftartikler og publikasjoner. Når artikler sendes til tidsskrifter, kan hver journal bruke husets stil på posttrykkversjonen . Fortrykkversjoner inneholder hvilken stil forfatteren tilfeldigvis brukte. Selv stilregimer som bruker små bokstaver for adjektivene gram-positive og gram-negative bruker vanligvis fortsatt kapital for Gram-flekker .