Knockout mus - Knockout mouse

En knockout-mus , eller knock-out mus , er en genmodifisert mus ( Mus musculus ) der forskere har inaktivert, eller " slått ut ", et eksisterende gen ved å erstatte den eller forstyrre den med et kunstig DNA- stykke . De er viktige dyremodeller for å studere rollen til gener som har blitt sekvensert, men hvis funksjoner ikke er bestemt. Ved å få et bestemt gen til å være inaktivt i musen, og observere forskjeller fra normal oppførsel eller fysiologi, kan forskere utlede dens sannsynlige funksjon.

Mus er for tiden de laboratoriedyrartene som er nærmest beslektet med mennesker som knockout -teknikken enkelt kan brukes på. De er mye brukt i knockout -eksperimenter, spesielt de som undersøker genetiske spørsmål som er knyttet til menneskelig fysiologi . Gen knockout hos rotter er mye vanskeligere og har bare vært mulig siden 2003.

Den første innspilte knockout -musen ble opprettet av Mario R. Capecchi , Martin Evans og Oliver Smithies i 1989, som de ble tildelt Nobelprisen i fysiologi eller medisin i 2007 for . Aspekter av teknologien for å generere knockout -mus, og musene selv har blitt patentert i mange land av private selskaper.

Bruk

En laboratoriemus der et gen som påvirker hårveksten er slått ut (til venstre), vises ved siden av en normal labmus.

Slå ut aktiviteten til et gen gir informasjon om hva det genet normalt gjør. Mennesker deler mange gener med mus. Følgelig gir observasjon av egenskapene til knockout -mus forskere informasjon som kan brukes til å bedre forstå hvordan et lignende gen kan forårsake eller bidra til sykdom hos mennesker.

Eksempler på forskning der knockout -mus har vært nyttige inkluderer å studere og modellere forskjellige typer kreft , fedme , hjertesykdom , diabetes , leddgikt , rusmisbruk , angst , aldring og Parkinsons sykdom . Knockout -mus tilbyr også en biologisk og vitenskapelig sammenheng der medisiner og andre terapier kan utvikles og testes.

Millioner av knockout -mus brukes i eksperimenter hvert år.

Stammer

En knockout -mus (til venstre) som er en modell for fedme, sammenlignet med en vanlig mus.

Det er flere tusen forskjellige stammer av knockout -mus. Mange musemodeller er oppkalt etter genet som har blitt inaktivert. For eksempel er p53 knockout -musen oppkalt etter p53 -genet som koder for et protein som normalt undertrykker veksten av svulster ved å stoppe celledeling og/eller indusere apoptose. Mennesker født med mutasjoner som deaktiverer p53-genet lider av Li-Fraumeni syndrom , en tilstand som dramatisk øker risikoen for å utvikle beinkreft, brystkreft og blodkreft i en tidlig alder. Andre musemodeller er navngitt i henhold til deres fysiske egenskaper eller oppførsel.

Fremgangsmåte

Prosedyren for å lage blastocyst av blandet genotype.
Avlssystem for produksjon av knockout -mus. Blastocyster som inneholder celler, som er både villtype- og knockout -celler, injiseres i livmoren til en fostermor. Dette produserer avkom som enten er villtype og farget i samme farge som blastocystdonoren (grå) eller kimæren (blandet) og delvis slått ut. Kimærmusene krysses med en normal villtype mus (grå). Dette produserer avkom som enten er hvite og heterozygote for det utslåtte genet eller grå og villtype. Hvite heterozygote mus kan deretter krysses for å produsere mus som er homozygote for det utslåtte genet.

Det er flere varianter av fremgangsmåten for å produsere knockout -mus; følgende er et typisk eksempel.

  1. Genet som skal slås ut er isolert fra et musegenbibliotek . Deretter konstrueres en ny DNA -sekvens som er veldig lik det opprinnelige genet og dets umiddelbare nabosekvens, bortsett fra at det er endret tilstrekkelig til å gjøre genet ubrukelig. Vanligvis får den nye sekvensen også et markørgen , et gen som normale mus ikke har, og som gir motstand mot et bestemt giftig middel (f.eks. Neomycin) eller som gir en observerbar endring (f.eks. Farge eller fluorescens). I tillegg er et andre gen, for eksempel herpes tk+, også inkludert i konstruksjonen for å oppnå et fullstendig utvalg.
  2. Embryonale stamceller isoleres fra en musblastocyst (et veldig ungt embryo ) og dyrkes in vitro . I dette eksemplet tar vi stamceller fra en hvit mus.
  3. Den nye sekvensen fra trinn 1 blir introdusert i stamcellene fra trinn 2 ved elektroporering . Ved den naturlige prosessen med homolog rekombinasjon vil noen av de elektroporerte stamcellene innlemme den nye sekvensen med det utslåtte genet i sine kromosomer i stedet for det opprinnelige genet. Sjansen for en vellykket rekombinasjonshendelse er relativt lav, så flertallet av endrede celler vil ha den nye sekvensen i bare ett av de to relevante kromosomene - de sies å være heterozygote . Celler som ble transformert med en vektor som inneholdt neomycinresistensgenet og herpes tk+ genet dyrkes i en løsning som inneholder neomycin og Ganciclovir for å velge for transformasjonene som skjedde via homolog rekombinasjon. Enhver innsetting av DNA som skjedde via tilfeldig innsetting vil dø fordi de tester positivt for både neomycinresistensgenet og herpes tk+ -genet, hvis genprodukt reagerer med Ganciclovir for å produsere et dødelig toksin. Videre tester celler som ikke integrerer noe av det genetiske materialet negative for begge genene og dør derfor som følge av forgiftning med neomycin.
  4. De embryonale stamcellene som inkorporerte det utslåtte genet isoleres fra de uforandrede cellene ved bruk av markørgenet fra trinn 1. For eksempel kan de uforandrede cellene drepes ved bruk av et giftig middel som de endrede cellene er resistente mot.
  5. De utslåtte embryonale stamcellene fra trinn 4 settes inn i en musblastocyst . I dette eksemplet bruker vi blastocyster fra en grå mus. Blastocystene inneholder nå to typer stamceller: de originale (fra den grå musen) og de utslåtte cellene (fra den hvite musen). Disse blastocystene blir deretter implantert i livmoren til hunnmus, hvor de utvikler seg. De nyfødte musene vil derfor være kimærer : Noen deler av kroppen deres skyldes de opprinnelige stamcellene, andre deler fra de utslåtte stamcellene. Pelsen deres vil vise flekker av hvitt og grått, med hvite flekker avledet fra de utslåtte stamcellene og grå flekker fra mottakerblastocysten.
  6. Noen av de nyfødte kimærmusene vil ha gonader som stammer fra utslåtte stamceller, og vil derfor produsere egg eller sæd som inneholder det utslåtte genet. Når disse kimærmusene krysses med andre av villtypen, vil noen av deres avkom ha en kopi av det utslåtte genet i alle cellene. Disse musene beholder ikke noe grått mus -DNA og er ikke kimærer, men de er fortsatt heterozygote.
  7. Når disse heterozygote avkomene blandes, vil noen av deres avkom arve det utslåtte genet fra begge foreldrene; de har ingen funksjonell kopi av det opprinnelige uforandrede genet (dvs. de er homozygote for den allelen).

En detaljert forklaring på hvordan knockout (KO) mus opprettes, ligger på nettstedet til Nobelprisen i fysiologi eller medisin 2007.

Begrensninger

National Institutes of Health diskuterer noen viktige begrensninger ved denne teknikken.

Selv om knockout -museteknologi representerer et verdifullt forskningsverktøy, finnes det noen viktige begrensninger. Omtrent 15 prosent av gene knockouts er utviklingsmessig dødelige, noe som betyr at de genetisk endrede embryoene ikke kan vokse til voksne mus. Dette problemet blir ofte overvunnet ved bruk av betingede mutasjoner . Mangelen på voksne mus begrenser studier til embryonal utvikling og gjør det ofte vanskeligere å bestemme et gens funksjon i forhold til menneskers helse . I noen tilfeller kan genet ha en annen funksjon hos voksne enn ved utvikling av embryoer.

Slå ut et gen kan også mislykkes i å produsere en observerbar endring i en mus eller kan til og med produsere forskjellige egenskaper fra de som er observert hos mennesker der det samme genet er inaktivert. For eksempel er mutasjoner i p53 -genet assosiert med mer enn halvparten av menneskelige kreftformer og fører ofte til svulster i et bestemt sett med vev. Men når p53 -genet slås ut hos mus, utvikler dyrene svulster i et annet utvalg av vev.

Det er variasjon i hele prosedyren, i stor grad avhengig av stammen stamcellene er hentet fra. Vanligvis brukes celler avledet fra stamme 129. Denne spesifikke stammen er ikke egnet for mange eksperimenter (f.eks. Atferdsmessig), så det er veldig vanlig å krysse avkomene til andre stammer. Noen genomiske loci har vist seg å være svært vanskelig å slå ut. Årsaker kan være tilstedeværelsen av repeterende sekvenser, omfattende DNA -metylering eller heterokromatin . Den forvirrende tilstedeværelsen av tilstøtende 129 gener på knockout-segmentet av genetisk materiale har blitt kalt "flanke-gen-effekten". Metoder og retningslinjer for å håndtere dette problemet har blitt foreslått.

En annen begrensning er at konvensjonelle (dvs. ikke-betingede) knockout-mus utvikler seg i fravær av genet som blir undersøkt. Noen ganger kan tap av aktivitet under utvikling maskere genets rolle i voksen tilstand, spesielt hvis genet er involvert i en rekke prosesser som spenner over utvikling. Betingede/induserbare mutasjonsmetoder er da påkrevd som først lar musen utvikle seg og modnes normalt før ablasjon av genet av interesse.

En annen alvorlig begrensning er mangel på evolutive tilpasninger i knockout -modellen som kan oppstå hos villdyr etter at de naturlig muterer. For eksempel, erytrocytt-spesifikk koekspresjon av GLUT1 med stomatin utgjør en kompenserende mekanisme i pattedyr som er i stand til å syntetisere vitamin C .

Se også

Referanser

Eksterne linker