Luciferase - Luciferase

Dinoflagellat Luciferase katalytisk domene
krystallstruktur av et luciferase -domene fra dinoflagellatet Lingulodinium polyedrum
Identifikatorer
Symbol	Luciferase_cat
Pfam	PF10285
InterPro	IPR018804
Tilgjengelige proteinstrukturer: Pfam   strukturer / ECOD   PDB RCSB PDB ; PDBe ; PDBj PDBsum struktur sammendrag

Luciferase er en generisk betegnelse for klassen av oksidative enzymer som produserer bioluminescens , og skilles vanligvis fra et fotoprotein . Navnet ble først brukt av Raphaël Dubois som oppfant ordene luciferin og luciferase, for henholdsvis enzymet og enzymet . Begge ordene er avledet fra det latinske ordet lucifer , som betyr "lightbearer", som igjen er avledet fra de latinske ordene for "light" ( lux) og "to bring or carry" ( ferre) .

Firefly luciferase
Struktur av Photinus pyralis firefly luciferase.
Identifikatorer
Organisme	Photinus pyralis
Symbol	Firefly luciferase
PDB	1LCI Flere strukturer
UniProt	P08659
Andre data
EF -nummer	1.13.12.7
Søk etter Strukturer Sveitsisk modell Domener InterPro

Luciferases er mye brukt i bioteknologi , for mikroskopi og som reportergener , for mange av de samme applikasjonene som fluorescerende proteiner . I motsetning til fluorescerende proteiner krever luciferaser imidlertid ikke en ekstern lyskilde , men krever tilsetning av luciferin , det forbrukbare substratet.

Eksempler

En rekke organismer regulerer lysproduksjonen ved hjelp av forskjellige luciferaser i en rekke lysemitterende reaksjoner. Flertallet av undersøkte luciferaser har blitt funnet hos dyr, inkludert ildfluer , og mange marine dyr som copepods , maneter og sjøfamilien . Imidlertid har luciferaser blitt studert i lysende sopp, som Jack-O-Lantern-sopp , samt eksempler i andre riker, inkludert lysende bakterier og dinoflagellater .

Firefly og klikkbille

De luciferaser av fireflies - som det er over 2000 arter - og av den andre Elateroidea (klikk biller og slektninger generelt) er mangfoldige nok til å være nyttig i molekyl phylogeny . I ildfluer tilføres oksygen som kreves gjennom et rør i magen som kalles buk -luftrøret . En godt studert luciferase er den til Photinini firefly Photinus pyralis , som har en optimal pH på 7,8.

Sjøblomster

Også godt studert er sjø stemorsblomst , reniformis Renilla . I denne organismen er luciferase ( Renilla-luciferin 2-monooksygenase ) nært knyttet til et luciferinbindende protein så vel som et grønt fluorescerende protein ( GFP ). Kalsium utløser frigjøring av luciferin ( coelenterazine ) fra luciferinbindende protein. Substratet er deretter tilgjengelig for oksidasjon av luciferase, hvor det nedbrytes til coelenteramid med en resulterende frigjøring av energi. I fravær av GFP vil denne energien frigjøres som en foton av blått lys (toppemisjon bølgelengde 482 nm). På grunn av den nært assosierte GFP blir energien som frigjøres av luciferase i stedet koblet gjennom resonansenergioverføring til fluoroforen til GFP, og frigjøres deretter som en foton av grønt lys (toppemisjon bølgelengde 510 nm). Den katalyserte reaksjonen er:

• coelenterazine + O ₂ → coelenteramid + CO ₂ + foton av lys

Copepod

Nyere luciferaser har nylig blitt identifisert som, i motsetning til andre luciferaser, er naturlig utskilt molekyler. Et slikt eksempel er Metridia coelenterazine -avhengig luciferase (MetLuc, A0A1L6CBM1 ) som er avledet fra den marine copepod Metridia longa . Den Metridia longa utskilt luciferase-genet koder for et 24 kDa protein som inneholder en N-terminal sekretorisk signal peptid på 17 aminosyrerester. Følsomheten og den høye signalintensiteten til dette luciferasemolekylet viser seg fordelaktig i mange reporterstudier. Noen av fordelene med å bruke et utskilt reportermolekyl som MetLuc er dens no-lysis-protokoll som gjør at man kan utføre levende celleanalyser og flere analyser på samme celle.

Bakteriell

Bakteriell bioluminescens sees hos Photobacterium -arter, Vibrio fischeri , Vibrio haweyi og Vibrio harveyi . Lysemisjon i enkelte bioluminescerende bakterier utnytter 'antenne' som for eksempel lumazine protein for å ta imot den energien fra den primære eksiterte tilstand på luciferase, noe som resulterer i en spent lulnazine kromofor som sender ut lys som er av en kortere bølgelengde (mer blått), mens i andre bruk et gult fluorescerende protein (YFP) med FMN som kromofor og avgir lys som er rødskiftet i forhold til det fra luciferase.

Dinoflagellat

Dinoflagellat luciferase er et eukaryotprotein med flere domener , bestående av et N-terminalt domene, og tre katalytiske domener , som hver foregår av et spiralbundet buntdomene. Den struktur av dinoflagellaten luciferase katalytiske domene har blitt løst. Kjernen del av domenet er et 10 strandet betatønnen som er strukturelt lik lipocalins og FABP . Det N-terminale domenet er konservert mellom dinoflagellat luciferase og luciferin bindende proteiner (LBP). Det har blitt antydet at denne regionen kan formidle en interaksjon mellom LBP og luciferase eller deres tilknytning til den vakuolære membranen. Det spiralformede buntdomenet har en bunnstruktur med tre spiraler som inneholder fire viktige histidiner som antas å spille en rolle i pH -reguleringen av enzymet . Det er en stor lomme i β-fatet til dinoflagellat luciferase ved pH 8 for å imøtekomme tetrapyrrol- substratet, men det er ingen åpning for å la substratet komme inn. Derfor må det oppstå en betydelig konformasjonsendring for å gi tilgang og plass til en ligand i det aktive stedet, og kilden for denne endringen er gjennom de fire N-terminale histidinrestene. Ved pH 8 kan det ses at de uprotonerte histidinrestene er involvert i et nettverk av hydrogenbindinger ved grensesnittet til spiralene i bunten som blokkerer substrattilgang til det aktive stedet og forstyrrelse av denne interaksjonen ved protonasjon (ved pH 6,3) eller ved å erstatte histidinrestene med alanin forårsaker en stor molekylær bevegelse av bunten, som skiller spiralene med 11Å og åpner det katalytiske stedet. Logisk sett kan histidinrestene ikke erstattes av alanin i naturen, men denne eksperimentelle erstatningen bekrefter videre at de større histidinrestene blokkerer det aktive stedet. I tillegg kan tre Gly-Gly-sekvenser, en i den N-terminale helixen og to i helix-loop-helix-motivet, tjene som hengsler som kjedene roterer rundt for ytterligere å åpne banen til det katalytiske stedet og forstørre det aktive nettstedet.

En dinoflagellat-luciferase er i stand til å avgi lys på grunn av samspillet med substratet ( luciferin ) og det luciferinbindende proteinet (LBP) i scintillon- organellen som finnes i dinoflagellater. Luciferasen virker i samsvar med luciferin og LBP for å avgi lys, men hver komponent fungerer ved en annen pH. Luciferase og dets domener er ikke aktive ved pH 8, men de er ekstremt aktive ved den optimale pH på 6,3, mens LBP binder luciferin ved pH 8 og frigjør det ved pH 6,3. Følgelig frigjøres luciferin bare for å reagere med en aktiv luciferase når scintillen surgjøres til pH 6,3. Derfor, for å senke pH, spenningsstyrte kanaler i scintillon membranen blir åpnet for å tillate oppføring av protoner fra en vakuole besitter et aksjonspotensial som produseres fra et mekanisk stimulering. Derfor kan det sees at virkningspotensialet i den vakuolære membranen fører til forsuring, og dette gjør at luciferin kan frigjøres for å reagere med luciferase i scintillon, noe som gir et blits av blått lys.

Reaksjonsmekanisme

Alle luciferaser er klassifisert som oksidoreduktaser ( EC 1.13.12.- ), noe som betyr at de virker på enkeltdonorer med inkorporering av molekylært oksygen. Fordi luciferaser er fra mange forskjellige proteinfamilier som ikke er relatert, er det ingen samlende mekanisme, ettersom noen mekanisme er avhengig av kombinasjonen luciferase og luciferin. Imidlertid har alle karakteriserte luciferase-luciferin-reaksjoner hittil vist seg å kreve molekylært oksygen på et eller annet tidspunkt.

Bakteriell luciferase

Reaksjonen katalysert av bakteriell luciferase er også en oksidativ prosess:

• FMNH ₂ + O ₂ + RCHO → FMN + RCOOH + H ₂ O + lys

I reaksjonen oksiderer molekylært oksygen flavinmononukleotid og et langkjedet alifatisk aldehyd til en alifatisk karboksylsyre . Reaksjonen danner et eksitert hydroksyflavin-mellomprodukt, som er dehydrert til produktet FMN for å avgi blågrønt lys.

Nesten all energi som tilføres reaksjonen blir til lys. Reaksjonen er 80% til 90% effektiv. Til sammenligning konverterer glødelampen bare omtrent 10% av energien til lys og en 150 lumen per watt (lm/W) LED konverterer 20% av inngangsenergien til synlig lys.

applikasjoner

Luciferaser kan produseres i laboratoriet gjennom genteknologi for en rekke formål. Luciferase -gener kan syntetiseres og settes inn i organismer eller transfekteres i celler. Fra og med 2002 er mus , silkeorm og poteter bare noen få av organismer som allerede er konstruert for å produsere proteinet.

I luciferase reaksjon, emitteres lys når luciferase virker på den aktuelle luciferin substratet . Fotonemisjon kan detekteres av lysfølsomme apparater som et luminometer eller modifiserte optiske mikroskoper . Dette tillater observasjon av biologiske prosesser. Siden lys eksitasjon ikke er nødvendig for luciferase bioluminescens, er det minimal autofluorescens og derfor praktisk talt bakgrunnsfri fluorescens. Derfor kan så lite som 0,02 pg fremdeles måles nøyaktig ved hjelp av en standard scintillasjonsteller .

I biologisk forskning brukes luciferase ofte som reporter for å vurdere transkripsjonell aktivitet i celler som er transfektert med en genetisk konstruksjon som inneholder luciferase -genet under kontroll av en promotor av interesse. I tillegg kan proluminescerende molekyler som omdannes til luciferin ved aktivitet av et bestemt enzym brukes til å påvise enzymaktivitet i koblede eller to-trinns luciferase-analyser. Slike substrater har blitt brukt til blant annet å påvise caspaseaktivitet og cytokrom P450 -aktivitet.

Luciferase kan også bli anvendt for å detektere nivået av cellulære ATP i celleviabilitet analyser eller for kinaseaktivitetsbestemmelser. Luciferase kan fungere som et ATP -sensorprotein gjennom biotinylering . Biotinylering vil immobilisere luciferase på celleoverflaten ved å binde seg til et streptavidin - biotinkompleks . Dette gjør at luciferase kan detektere utstrømningen av ATP fra cellen og vil effektivt vise frigjøring av ATP i sanntid gjennom bioluminescens. Luciferase kan i tillegg bli gjort mer følsomme for ATP påvisning ved å øke intensiteten luminescens ved å endre visse aminosyrerester i sekvensen av proteinet.

Hele avbildning av dyr (referert til som in vivo når du lever eller, på annen måte kalt ex vivo -bildebehandling) er en kraftig teknikk for å studere cellepopulasjoner i levende dyr, for eksempel mus. Ulike celletyper (f.eks. Benmargsstamceller, T-celler) kan konstrueres for å uttrykke en luciferase som tillater deres ikke-invasive visualisering inne i et levende dyr ved hjelp av et sensitivt ladningspar-kamera ( CCD-kamera ). Denne teknikken har blitt brukt å følge tumorigenese og respons av svulster på behandling i dyremodeller. Imidlertid kan miljøfaktorer og terapeutiske forstyrrelser forårsake noen avvik mellom tumorbyrde og bioluminescensintensitet i forhold til endringer i proliferativ aktivitet. Intensiteten til signalet målt ved in vivo-avbildning kan avhenge av forskjellige faktorer, for eksempel absorpsjon av D-luciferin gjennom bukhinnen, blodstrøm, cellemembranpermeabilitet, tilgjengelighet av ko-faktorer, intracellulær pH og transparens av overliggende vev, i tillegg til mengden luciferase.

Luciferase er et varmefølsomt protein som brukes i studier på proteindaturering , og tester beskyttelseskapasiteten til varmesjokkproteiner . Mulighetene for bruk av luciferase fortsetter å utvide.

Se også

• Luciferin
• Bioluminescens avbildning
• Kvorumfølelse
• Bioluminescerende bakterier

Referanser

Eksterne linker