Mikroskala termoforese - Microscale thermophoresis
Mikroskala termoforese ( MST ) er en teknologi for biofysisk analyse av interaksjoner mellom biomolekyler . Mikroskala termoforese er basert på påvisning av en temperaturindusert endring i fluorescens av et mål som en funksjon av konsentrasjonen av en ikke-fluorescerende ligand. Den observerte endringen i fluorescens er basert på to forskjellige effekter. På den ene siden er den basert på en temperaturrelatert intensitetsendring (TRIC) av den fluorescerende sonden, som kan påvirkes av bindingshendelser. På den annen side er den basert på termoforese , den riktede bevegelsen av partikler i en mikroskopisk temperaturgradient . Enhver endring av det kjemiske mikromiljøet til den fluorescerende sonden, samt endringer i hydratiseringsskallet til biomolekyler resulterer i en relativ endring av fluorescensen som oppdages når en temperaturgradient påføres og kan brukes til å bestemme bindingsaffiniteter . MST tillater måling av interaksjoner direkte i løsning uten behov for immobilisering til en overflate (immobilisasjonsfri teknologi).
applikasjoner
Affinitet
- mellom alle slags biomolekyler inkludert proteiner , DNA , RNA , peptider, små molekyler , fragmenter og ioner
- for interaksjoner med komplekser med høy molekylvekt, store molekylsammensetninger, selv med liposomer , vesikler , nanodisker , nanopartikler og virus
- i en hvilken som helst buffer, inkludert serum og cellelysat
- i konkurranseeksperimenter (for eksempel med substrat og hemmere)
Termodynamiske parametere
MST har blitt brukt til å estimere de entalpiske og entropiske bidragene til biomolekylære interaksjoner.
Tilleggsinformasjon
- Eksempelegenskap (homogenitet, aggregering, stabilitet)
- Flere bindingssteder, samarbeid
Teknologi
MST er basert på den kvantifiserbare deteksjonen av en fluorescensendring i en prøve når en temperaturendring påføres. Fluorescensen til et målmolekyl kan være ekstrinsisk eller iboende (aromatiske aminosyrer ) og endres i temperaturgradienter på grunn av to forskjellige effekter. På den ene siden temperaturrelatert intensitetsendring (TRIC), som beskriver fluoroforers egenskap til å endre fluorescensintensiteten som en funksjon av temperaturen. Omfanget av endringen i fluorescensintensitet påvirkes av det kjemiske miljøet i den fluorescerende sonden, som kan endres i bindingshendelser på grunn av konformasjonsendringer eller nærhet til ligander . På den annen side er MST også basert på den riktede bevegelsen av molekyler langs temperaturgradienter, en effekt som kalles termoforese. En romlig temperaturforskjell ΔT fører til en endring i molekylkonsentrasjon i området med forhøyet temperatur, kvantifisert med Soret-koeffisienten S T : c varm /c kald = eksp (-S T AT). Både TRIC og termoforese bidrar til det registrerte signalet i MST -målinger på følgende måte: ∂/∂T (cF) = c∂F/∂T+F∂c/∂T. Det første uttrykket i denne ligningen c∂F/∂T beskriver TRIC som en endring i fluorescensintensitet (F) som en funksjon av temperaturen (T), mens det andre uttrykket F∂c/∂T beskriver termoforese som endringen i partikkelkonsentrasjon (c) som en funksjon av temperaturen. Termoforese avhenger av grensesnittet mellom molekyl og løsningsmiddel. Under konstante bufferforhold sonderer termoforese molekylenes størrelse, ladning og løsningsentropi. Termoforese av et fluorescerende merket molekyl A skiller seg vanligvis vesentlig fra termoforese av et molekylmålkompleks AT på grunn av forskjeller i størrelse, ladning og løsningsentropi. Denne forskjellen i molekylets termoforese brukes til å kvantifisere bindingen i titreringseksperimenter under konstante bufferforhold.
Den termoforetiske bevegelsen til det fluorescerende merkede molekylet måles ved å overvåke fluorescensfordelingen F inne i en kapillær. Den mikroskopiske temperaturgradienten genereres av en IR-laser, som fokuseres inn i kapillæren og absorberes sterkt av vann. Temperaturen på den vandige løsningen i laserpunktet økes med ΔT = 1-10 K. Før IR-laseren slås på, observeres en homogen fluorescensfordeling F kald inne i kapillæren. Når IR-laseren slås på, oppstår to effekter på samme tidsskala, noe som bidrar til den nye fluorescensfordelingen F hot . Den termiske avslapningen induserer et bindingsavhengig fall i fargestoffets fluorescens på grunn av dets lokale miljøavhengige respons på temperaturhoppet (TRIC). Samtidig beveger molekyler seg vanligvis fra det lokalt oppvarmede området til de ytre kalde områdene. Den lokale konsentrasjonen av molekyler avtar i det oppvarmede området til den når en steady-state-fordeling.
Mens massediffusjonen D dikterer kinetikken for uttømming, bestemmer S T konsentrasjonsforholdet for steady-state c varmt /c kaldt = exp (-S T ΔT) ≈ 1-S T ΔT under en temperaturøkning ΔT. Den normaliserte fluorescensen F -norm = F varm /F kald måler hovedsakelig dette konsentrasjonsforholdet, i tillegg til TRIC ∂F /∂T. I den lineære tilnærmingen finner vi: F norm = 1+(∂F/∂TS T ) ΔT. På grunn av lineariteten til fluorescensintensiteten og den termoforetiske uttømmingen, superponerer den normaliserte fluorescensen fra det ubundne molekylet F -norm (A) og det bundne komplekse F -normet (AT) lineært. Ved å angi x brøkdelen av molekyler bundet til mål, er det skiftende fluorescenssignalet under titrering av mål T gitt av: F norm = (1-x) F norm (A)+x F norm (AT).
Kvantitative bindingsparametere oppnås ved bruk av en seriell fortynning av bindingssubstratet. Ved å plotte F -norm mot logaritmen til de forskjellige konsentrasjonene i fortynningsserien, oppnås en sigmoidal bindingskurve. Denne bindingskurven kan direkte utstyres med den ikke -lineære løsningen av loven om massevirkning , med dissosiasjonskonstanten K D som resultat.