Molekylært fyrtårn - Molecular beacon
Molecular sjømerker , eller molekylære beacon prober , er oligo- hybridiseringsprober som kan rapportere tilstedeværelsen av spesifikke nukleinsyrer i homogene oppløsninger. Molekylære radiofyr er hårnål formede molekyler med en innvendig bråkjølt fluorofor hvis fluorescens blir gjenopprettet når de binder til en target-nukleinsyresekvens. Dette er en ny ikke- radioaktiv metode for å påvise spesifikke sekvenser av nukleinsyrer. De er nyttige i situasjoner der det enten ikke er mulig eller ønskelig å isolere sonde-mål-hybrider fra et overskudd av hybridiseringsprober.
Molekylære fyrtester
En typisk molekylær beacon -sonde er 25 nukleotider lang. De midterste 15 nukleotidene er komplementære til mål -DNA eller RNA og baserer seg ikke med hverandre, mens de fem nukleotidene ved hver ende er komplementære til hverandre i stedet for til mål -DNA. En typisk molekylær ledestruktur kan deles i 4 deler: 1) sløyfe, en 18–30 baseparregion av det molekylære fyret som er komplementær til målsekvensen; 2) stamme dannet av festingen til begge endene av sløyfen til to korte (5 til 7 nukleotidrester) oligonukleotider som er komplementære med hverandre; 3) 5' -fluorofor i 5' -enden av molekylfyret, et fluorescerende fargestoff er kovalent festet; 4) 3 'quencher (ikke -fluorescerende) fargestoff som er kovalent festet til 3' -enden av det molekylære fyret. Når fyrtårnet er i lukket sløyfeform, ligger slukkeren i nærheten av fluoroforen, noe som resulterer i at den fluorescerende emisjonen til sistnevnte slås av.
Hvis nukleinsyren som skal påvises er komplementær til strengen i sløyfen, skjer hybridisering . Dupleksen som dannes mellom nukleinsyren og sløyfen er mer stabil enn stammen fordi den tidligere dupleksen involverer flere basepar. Dette forårsaker separasjon av stammen og derav fluoroforen og slukkeren. Når fluoroforen ikke lenger er ved siden av slukkeren, resulterer belysning av hybriden med lys i fluorescerende utslipp. Tilstedeværelsen av utslipp rapporterer at hendelsen med hybridisering har skjedd, og derfor er målnukleinsyresekvensen tilstede i testprøven.
Bruk i celleteknikk
Fluorogene signal-oligonukleotidprober ble rapportert for bruk for å detektere og isolere celler som uttrykker ett eller flere ønskede gener, inkludert produksjon av multigenstabile cellelinjer som uttrykker heteromultimer epitelnatriumkanal (αβγ-ENaC), natriumspenning-gated ionkanal 1.7 (NaV1.7 -αβ1β2), fire unike γ-aminosmørsyre A (GABAA) reseptorionkanal-underenhetskombinasjoner α1β3γ2s, α2β3γ2s, α3β3γ2s og α5β3γ2s, cystic fibrosis conductance regulator (CFTR), CFTR-Δ508s.
Syntese
Molekylære fyrtårn er syntetiske oligonukleotider hvis forberedelse er godt dokumentert. I tillegg til det konvensjonelle settet med nukleosidfosforamiditter , krever syntesen også en solid bærer derivatisert med en slukker og en fosforamidittblokk designet for festing av et beskyttet fluorescerende fargestoff.
Den første bruken av begrepet molekylære beacons, syntese og demonstrasjon av funksjon var i 1996.
Alternative homogene analyseteknologier
- 5'-nuklease TaqMan-analyse
- Exciton-kontrollerte hybridiseringsfølsomme fluorescerende oligonukleotid (ECHO) sonder.
- Dual Hybridization (LightCycler®) sonder
- Scorpions® Probes
- LUX (Light Upon Extension) prober
- DNA -bindende fargestoffanalyser (f.eks. SYBR Green, SYTO9, Melt Doctor, LCGreen Plus, etc.)
applikasjoner
- SNP -deteksjon
- Nukleinsyredeteksjon i sanntid
- Sanntids PCR-kvantifisering
- Allelisk diskriminering og identifikasjon
- Multiplex PCR -analyser
- Diagnostiske kliniske analyser