Nukleinsyre test - Nucleic acid test

Rotavirus

En nukleinsyretest ( NAT ) er en teknikk som brukes til å detektere en bestemt nukleinsyresekvens og dermed vanligvis for å oppdage og identifisere en bestemt art eller underart av organisme, ofte et virus eller en bakterie som fungerer som et patogen i blod , vev , urin , etc. NATer skiller seg fra andre tester ved at de påviser genetiske materialer ( RNA eller DNA ) i stedet for antigener eller antistoffer . Påvisning av genetiske materialer tillater en tidlig diagnose av en sykdom fordi påvisning av antigener og/eller antistoffer krever tid før de begynner å vises i blodet. Siden mengden av et bestemt genetisk materiale vanligvis er veldig liten, inkluderer mange NAT et trinn som forsterker det genetiske materialet - det vil si at det gjør mange kopier av det. Slike NAT kalles nukleinsyreforsterkningstester ( NAAT ). Det er flere måter å amplifisere på, inkludert polymerasekjedereaksjon (PCR), strengforskyvningsanalyse (SDA) eller transkripsjonsmediert analyse (TMA).

Nesten alle nukleinsyreforsterkningsmetoder og deteksjonsteknologier bruker spesifisiteten til Watson-Crick- baseparring ; enkeltstrengede probe- eller primermolekyler fanger DNA- eller RNA- målmolekyler av komplementære tråder . Derfor er utformingen av sondestrenger svært viktig for å øke følsomheten og spesifisiteten til deteksjonen. Imidlertid er mutantene som danner det genetiske grunnlaget for en rekke menneskelige sykdommer vanligvis litt forskjellige fra de normale nukleinsyrene. Ofte er de bare forskjellige i en enkelt base, f.eks. Innsetting , sletting og enkeltnukleotidpolymorfisme (SNP). I dette tilfellet kan det lett oppstå ufullkomne sonde-målbinding, noe som resulterer i falskt positive resultater, for eksempel ved å feile en stamme som er commensal for en som er patogen. Mye forskning har vært dedikert til å oppnå enkelhetsbasert spesifisitet.

Fremskritt

Nukleinsyre (DNA og RNA) tråder med korresponderende sekvenser henger sammen i parvise kjeder, glidelås opp som borrelås i en tørketrommel. Men hver node i kjeden er ikke veldig klissete, så den dobbeltstrengede kjeden kommer kontinuerlig halvt opp med glidelås og glidelås igjen under påvirkning av omgivende vibrasjoner (referert til som termisk støy eller brunsk bevegelse ). Lengre sammenkoblinger er mer stabile. Nukleinsyretester bruker en "sonde" som er en lang streng med en kort tråd festet til den. Den lange primerstrengen har en tilsvarende (komplementær) sekvens til en "mål" -streng fra sykdomsorganismen som blir påvist. Sykdomstråden fester seg tett til den eksponerte delen av den lange primerstrengen (kalt "tåhold"), og fortrenger deretter litt etter litt den korte "beskytter" -strengen fra sonden. Til slutt er den korte beskytterstrengen ikke bundet til noe, og den ubundne korte primeren er påviselig. Resten av denne delen gir litt historie om forskningen som trengs for å finjustere denne prosessen til en nyttig test.

I 2012 publiserte Yins forskningsgruppe et papir om optimalisering av spesifisiteten til nukleinsyrehybridisering. De introduserte en 'tåholdsutvekslingsprobe (PC)' som består av en forhåndshybridisert komplementstreng C og en beskytterstreng P. Komplementstrengen er lengre enn beskytterstrengen for å ha ubunden hale til slutt, en tåholder. Komplement komplementerer perfekt med målsekvensen. Når det riktige målet (X) reagerer med tåtholderen (PC), frigjøres P og det hybridiserte produktet XC dannes. Standard fri energi (∆) for reaksjonen er nær null. På den annen side, hvis tåleutvekslingsproben (PC) reagerer med falskt mål (S), går reaksjonen fremover, men standard fri energi øker til å være mindre termodynamisk gunstig. Standard fri energiforskjell (∆∆) er betydelig nok til å gi åpenbar diskriminering i utbytte. Diskrimineringsfaktoren Q beregnes som utbyttet av korrekt målhybridisering dividert med utbyttet av falsk målhybridisering. Gjennom eksperimentene på forskjellige utvekslingsprober med 5 riktige mål og 55 falske mål med energisk representative enebaseendringer (erstatninger, slettinger og innsetting), konkluderte Yins gruppe med at diskrimineringsfaktorer for disse sonderene var mellom 3 og 100 + med medianen 26. Proberne fungerer robust fra 10 ° C til 37 ° C, fra 1 mM til 47 mM, og med nukleinsyrekonsentrasjoner fra 1 nM til 5 M. De fant også ut at tåholdsutvekslingsprober fungerer robust selv i RNA -deteksjon.

Ytterligere undersøkelser har blitt studert deretter. I 2013 publiserte Seeligs gruppe et papir om fluorescerende molekylære prober som også bruker tåtholdingsutvekslingsreaksjonen. Dette muliggjorde optisk deteksjon av riktig mål og SNP -mål. De lyktes også med påvisning av SNPer i E. coli-avledede prøver.

I 2015 oppnådde Davids gruppe ekstremt høy (1000+) selektivitet av enkelt-nukleotidvarianter (SNV) ved å introdusere systemet som kalles 'konkurransedyktige komposisjoner'. I dette systemet konstruerte de en kinetisk reaksjonsmodell av de underliggende hybridiseringsprosessene for å forutsi de optimale parameterverdiene, som varierer basert på sekvensene til SNV og villtype (WT), på designarkitekturen til sonden og vasken og på reagenset konsentrasjoner og analyseforhold. Modellen deres lyktes med en median 890-fild selektivitet for 44 kreftrelaterte DNA SNVer, med minimum 200, noe som representerer minst en 30 ganger forbedring i forhold til tidligere hybridiseringsbaserte analyser. I tillegg brukte de denne teknologien for å analysere lave VAF -sekvenser fra humant genomisk DNA etter PCR, så vel som direkte på syntetiske RNA -sekvenser.

Basert på ekspertisen utviklet de en ny PCR -metode kalt Blocker Displacement Amplification (BDA). Det er en temperatur-robust PCR som selektivt forsterker alle sekvensvarianter i et omtrent 20 nt vindu med 1000 ganger over villtypesekvenser, noe som muliggjør enkel deteksjon og kvantifisering av hundrevis av potensialvarianter opprinnelig med ≤ 0,1% allelfrekvens. BDA oppnår lignende berikelsesytelse over annealtemperaturer fra 56 ° C til 64 ° C. Denne temperatur robustheten letter multiplexert berikelse av mange forskjellige varianter på tvers av genomet, og muliggjør dessuten bruk av dyre og bærbare termosyklusinstrumenter for deteksjon av sjeldne DNA-varianter. BDA har blitt validert selv på prøvetyper, inkludert kliniske cellefrie DNA-prøver samlet inn fra blodplasmaet til lungekreftpasienter.

applikasjoner

  • Diagnose av gonokokker og andre Neisserial -infeksjoner: Forsterkning av spesifikke N. gonoré -DNA- eller RNA -sekvenser for påvisning.
  • Diagnose av urogenitale C. trachomatis -infeksjoner
  • Påvisning av Mycobacterium tuberculosis
  • Påvisning av HIV RNA eller DNA
  • Påvisning av zoonotiske koronavirus
  • Diagnostisk test for SARS-CoV-2

Referanser