Deoksyribozym - Deoxyribozyme
Deoxyribozymes , også kalt DNA-enzymer , DNAzymes eller katalytisk DNA , er DNA- oligonukleotider som er i stand til å utføre en spesifikk kjemisk reaksjon , ofte men ikke alltid katalytisk . Dette ligner virkningen av andre biologiske enzymer , for eksempel proteiner eller ribozymer (enzymer sammensatt av RNA ). I motsetning til overflod av proteinenzymer i biologiske systemer og oppdagelsen av biologiske ribozymer på 1980 -tallet, er det imidlertid bare få bevis for naturlig forekommende deoksyribozymer. Deoksyribozymer bør ikke forveksles med DNA -aptamerer som er oligonukleotider som selektivt binder en målligand , men ikke katalyserer en påfølgende kjemisk reaksjon.
Med unntak av ribozymer, fungerer nukleinsyremolekyler i cellene først og fremst som lagring av genetisk informasjon på grunn av dets evne til å danne komplementære basepar , noe som muliggjør kopiering og overføring av genetisk informasjon i høy kvalitet . I kontrast er nukleinsyremolekyler mer begrenset i sin katalytiske evne, sammenlignet med proteinenzymer, til bare tre typer interaksjoner: hydrogenbinding , pi-stabling og metall-ion-koordinering . Dette skyldes det begrensede antallet funksjonelle grupper av nukleinsyremonomerene : Mens proteiner er bygget fra opptil tjue forskjellige aminosyrer med forskjellige funksjonelle grupper, er nukleinsyrer bygget av bare fire kjemisk like nukleobaser . I tillegg mangler DNA 2'- hydroksylgruppen som finnes i RNA, noe som begrenser den katalytiske kompetansen til deoksyribozymer selv i forhold til ribozymer.
I tillegg til den iboende mindreverdigheten til DNA-katalytisk aktivitet, kan den tilsynelatende mangelen på naturlig forekommende deoksyribozymer også skyldes den primært dobbeltstrengede konformasjonen av DNA i biologiske systemer som ville begrense dens fysiske fleksibilitet og evne til å danne tertiære strukturer , og det ville det også drastisk begrense evnen til dobbeltstrenget DNA til å fungere som en katalysator; selv om det er noen få kjente forekomster av biologisk enkeltstrenget DNA som multikopi enkeltstrenget DNA (msDNA), visse virale genomer og replikasjonsgaffelen som dannes under DNA-replikasjon. Ytterligere strukturelle forskjeller mellom DNA og RNA kan også spille en rolle i mangel på biologiske deoksyribozymer, for eksempel den ekstra metylgruppen av DNA-basen tymidin sammenlignet med RNA-basen uracil eller tendensen til DNA til å adoptere B-formspiralen mens RNA har en tendens til å adoptere A-formspiralen . Imidlertid har det også blitt vist at DNA kan danne strukturer som RNA ikke kan, noe som tyder på at selv om det er forskjeller i strukturer som hver kan danne, er hverken iboende mer eller mindre katalytisk på grunn av deres mulige strukturelle motiver.
Typer
Ribonukleaser
_DNAzyme.png)
Den mest forekommende klasse av deoxyribozymes er ribonukleaser , som katalyserer spalting av et ribonukleotid fosfodiesterbinding via en transforestringsreaksjon, danner en 2'3'-cyklisk fosfat terminale ende og en 5'- hydroksyl- terminus. Ribonuklease-deoksyribozymer gjennomgår vanligvis seleksjon som lange, enkeltstrengede oligonukleotider som inneholder en enkelt ribonukleotidbase for å fungere som spaltningsstedet. Når den er sekvensert, kan denne enkeltstrengede "cis" -formen til deoksyribozymet omdannes til den tostrengede "trans" -formen ved å skille substratdomenet (som inneholder ribonukleotid-spaltningssetet) og enzymdomenet (som inneholder den katalytiske kjernen) i separate tråder som kan hybridisere gjennom to flankeringsarmer bestående av komplementære basepar .
Det første kjente deoksyribozymet var en ribonuklease, oppdaget i 1994 av Ronald Breaker mens han var postdoktor i laboratoriet til Gerald Joyce ved Scripps Research Institute . Dette deoksyribozymet, senere kalt GR-5, katalyserer Pb2 + -avhengig spaltning av en enkelt ribonukleotidfosfoester med en hastighet som er mer enn 100 ganger sammenlignet med den ukatalyserte reaksjonen. Deretter ble ytterligere RNA-spaltende deoxyribozymes som inneholder forskjellige metall kofaktorer ble utviklet, herunder Mg 2 + -avhengige E2 deoxyribozyme og Ca 2 + -avhengig Mg5 deoxyribozyme. Disse første deoksyribosymene klarte ikke å katalysere en full RNA -substratstreng, men ved å inkorporere hele RNA -substratstrengen i utvelgelsesprosessen, kunne deoksyribozymer som fungerte med substrater bestående av enten fullt RNA eller fullt DNA med en enkelt RNA -base, brukes . Den første av disse mer allsidige deoksyribosymene, 8-17 og 10-23, er for tiden de mest studerte deoksyribosymene. Faktisk ble det funnet at mange senere oppdagede deoksyribozymer inneholdt det samme katalytiske kjernemotivet som 8-17, inkludert det tidligere oppdagede Mg5, noe som antyder at dette motivet representerer den "enkleste løsningen for RNA-spaltningsproblemet". 10-23 DNA-enzymet inneholder en 15-nukleotid katalytisk kjerne som er flankert av to substratgjenkjenningsdomener. Dette DNA -enzymet klyver komplementære RNA effektivt på en sekvens -spesifikk måte mellom et uparret purin og et paret pyrimidin. DNA -enzymer rettet mot AU eller GU vs. GC eller AC er mer effektive. Videre har RNA -spaltningshastigheter vist seg å øke etter introduksjonen av interkalatorer eller substitusjon av deoksyguanin med deoksyinosin i krysset mellom den katalytiske sløyfen. Spesielt viste tilsetning av 2'-O-metyl-modifikasjoner til det katalytiske å øke spaltningshastigheten betydelig både in vitro og in vivo. Andre bemerkelsesverdige deoksyribozymribonukleaser er de som er svært selektive for en bestemt kofaktor. Blant denne gruppen er metallet selektive deoxyribozymes slik som Pb 2+ -spesifikk 17E, UO 2 2+ -spesifikke 39E, og Na + -spesifikke A43. Den første krystallstrukturen til et DNA-enzym ble rapportert i 2016. 10-23 kjernebaserte DNA-enzymer og de respektive MNA-enzymer som katalyserer reaksjoner ved omgivelsestemperaturer ble beskrevet i 2018 og åpner dører for bruk av disse nukleinsyrebaserte enzymer til mange andre applikasjoner uten behov for oppvarming.
Denne lenken og denne koblingen beskriver DNA-molekylet 5'-GGAGAACGCGAGGCAAGGCTGGGAGAATGTGGATCACGATT-3 ', som fungerer som et deoksyribozym som bruker lys til å reparere en tymindimer , ved bruk av serotonin som kofaktor .
RNA -ligaser
Av særlig interesse er DNA -ligaser . Disse molekylene har vist bemerkelsesverdig kjemoselektivitet i RNA -forgreningsreaksjoner . Selv om hver gjentagende enhet i en RNA -streng eier en fri hydroksylgruppe , tar DNA -ligasen bare en av dem som et forgreningsutgangspunkt. Dette kan ikke gjøres med tradisjonell organisk kjemi .
Andre reaksjoner
Mange andre deoxyribozymes har siden blitt utviklet som katalyserer fosforylering DNA, DNA adenylering , DNA deglykosylering , porfyrin metallering , tymin dimer photoreversion og DNA-spalting.
Metoder
in vitro utvalg
Fordi det ikke er kjent naturlig forekommende deoksyribozymer, har de fleste kjente deoksyribozym-sekvensene blitt oppdaget gjennom en seleksjonsmetode med høy gjennomstrømning in vitro , lik SELEX . in vitro utvalg benytter en "pool" av et stort antall tilfeldig DNA-sekvenser (typisk 10 14 -10 15 unike tråder) som kan bli screenet for en spesifikk katalytisk aktivitet. Bassenget syntetiseres gjennom fastfasesyntese slik at hver streng har to konstante områder ( primerbindingssteder for PCR -forsterkning) som flankerer et tilfeldig område med en viss lengde, vanligvis 25–50 baser lang. Dermed er det totale antallet unike tråder, kalt sekvensrommet, 4 N hvor N angir antall baser i det tilfeldige området. Fordi 4 25 ≈ 10 15 , er det ingen praktisk grunn til å velge tilfeldige områder med mindre enn 25 baser i lengde, mens å gå over dette antallet baser betyr at det totale sekvensområdet ikke kan måles. Siden det sannsynligvis er mange potensielle kandidater for en gitt katalytisk reaksjon i sekvensrommet, har tilfeldige områder på 50 og enda høyere med hell gitt katalytiske deoksyribozymer.
Bassenget blir først utsatt for et utvalgstrinn, hvor de katalytiske strengene skilles fra de ikke-katalytiske strengene. Den nøyaktige separasjonsmetoden vil avhenge av reaksjonen som katalyseres. Som et eksempel benytter separasjonstrinnet for ribonukleotidspaltning ofte affinitetskromatografi , der en biologisk tag festet til hver DNA -streng blir fjernet fra alle katalytisk aktive tråder via spaltning av en ribonukleotidbase. Dette gjør at de katalytiske strengene kan skilles av en kolonne som spesifikt binder taggen, siden de ikke-aktive strengene forblir bundet til kolonnen mens de aktive trådene (som ikke lenger har taggen) flyter gjennom. Et vanlig oppsett for dette er en biotinkode med en streptavidin- affinitetskolonne. Gelelektroforese basert separasjon kan også brukes der endringen i molekylvekt av tråder ved spaltningsreaksjonen er nok til å forårsake et skifte i plasseringen av de reaktive strengene på gelen. Etter seleksjonstrinnet blir det reaktive bassenget amplifisert via polymerasekjedereaksjon (PCR) for å regenerere og amplifisere de reaktive strengene, og prosessen gjentas inntil det oppnås et basseng med tilstrekkelig reaktivitet. Flere valgrunder er påkrevd fordi noen ikke-katalytiske tråder uunngåelig vil klare det gjennom et hvilket som helst utvalgstrinn. Vanligvis kreves 4–10 runder for entydig katalytisk aktivitet, selv om flere runder ofte er nødvendige for strengere katalytiske forhold. Etter et tilstrekkelig antall runder sekvenseres det siste bassenget og de enkelte strengene testes for deres katalytiske aktivitet. Dynamikken i bassenget kan beskrives gjennom matematisk modellering, som viser hvordan oligonukleotider gjennomgår konkurransebinding med målene og hvordan det evolusjonære resultatet kan forbedres gjennom finjustering av parametere.
Deoksyribozymer oppnådd gjennom seleksjon in vitro vil bli optimalisert for forholdene under utvelgelsen, for eksempel saltkonsentrasjon , pH og tilstedeværelse av kofaktorer . På grunn av dette kan katalytisk aktivitet bare i nærvær av spesifikke kofaktorer eller andre forhold oppnås ved bruk av positive seleksjonstrinn, så vel som negative seleksjonstrinn mot andre uønskede forhold.
in vitro evolusjon
En lignende metode for å skaffe nye deoksyribozymer er gjennom in vitro evolusjon. Selv om dette begrepet ofte brukes om hverandre med in vitro -utvalg, refererer in vitro -evolusjon mer hensiktsmessig til en litt annen prosedyre der den første oligonukleotidpoolen blir genetisk endret over påfølgende runder gjennom genetisk rekombinasjon eller gjennom punktmutasjoner . For punktmutasjoner kan bassenget forsterkes ved hjelp av feilutsatt PCR for å produsere mange forskjellige tråder av forskjellige tilfeldige, enkeltmutasjoner. Som med seleksjon in vitro , vil de utviklede strengene med økt aktivitet ha en tendens til å dominere bassenget etter flere utvalgstrinn, og når en tilstrekkelig katalytisk aktivitet er nådd, kan bassenget sekvenseres for å identifisere de mest aktive strengene.
Det første bassenget for in vitro -evolusjon kan stammer fra en innsnevret delmengde av sekvensrom, for eksempel en viss runde av et in vitro -utvalgseksperiment, som noen ganger også kalles in vitro reselection. Den første puljen kan også stammer fra amplifikasjon av en enkelt oligonukleotidstreng. Som et eksempel på sistnevnte viste en nylig studie at et funksjonelt deoksyribozym kan velges gjennom in vitro- utvikling av en ikke-katalytisk oligonukleotidforløperstreng. Et vilkårlig valgt DNA -fragment avledet fra mRNA -transkripsjonen av bovint serumalbumin ble utviklet gjennom tilfeldige punktmutasjoner over 25 seleksjonsrunder. Gjennom dyp sekvenseringsanalyse av forskjellige bassenggenerasjoner kunne utviklingen av den mest katalytiske deoksyribozymstrengen spores gjennom hver påfølgende enkelt mutasjon. Denne første vellykkede utviklingen av katalytisk DNA fra en ikke-katalytisk forløper kan gi støtte for RNA World- hypotesen. I en annen nylig studie ble et RNA-ligase-ribozym omdannet til et deoksyribozym gjennom in vitro- utvikling av den inaktive deoksyribo-analogen til ribozymet. Det nye RNA -ligase deoksyribozym inneholdt bare tolv punktmutasjoner, hvorav to ikke hadde noen effekt på aktivitet, og hadde en katalytisk effektivitet på omtrent 1/10 av det opprinnelige ribozymet, selv om forskningen antok at aktiviteten kunne økes ytterligere gjennom ytterligere seleksjon. Dette første beviset for overføring av funksjon mellom forskjellige nukleinsyrer kan gi støtte for forskjellige hypoteser før RNA-verden .
"Sann" katalyse?
Fordi de fleste deoksyribozymer lider av produktinhibering og dermed viser atferd med én omsetning , blir det noen ganger hevdet at deoksyribozymer ikke viser "ekte" katalytisk oppførsel siden de ikke kan gjennomgå katalyse med flere omsetninger som de fleste biologiske enzymer . Den generelle definisjonen av en katalysator krever imidlertid bare at stoffet fremskynder hastigheten på en kjemisk reaksjon uten å bli forbrukt av reaksjonen (dvs. at den ikke er permanent kjemisk endret og kan resirkuleres). Ved denne definisjonen er deoksiribozymer med én omsetning faktisk katalysatorer. Videre viser mange endogene enzymer (både proteiner og ribozymer ) også atferd med én omsetning, og derfor ser utelukkelse av deoksyribozymer fra rang som "katalysator" rett og slett fordi den ikke har adferd med flere omsetninger, ubegrunnet ut.
applikasjoner
Selv om RNA -enzymer ble oppdaget før DNA -enzymer, har sistnevnte noen klare fordeler. DNA er mer kostnadseffektivt , og DNA kan lages med lengre sekvenslengde og kan lages med høyere renhet ved fastfasesyntese . Flere studier har vist bruk av DNA -enzymer for å hemme influensa A- og B -virusreplikasjon i vertsceller. DNA-enzymer har også vist seg å hemme replikasjon av SARS-coronavirus (SARS-CoV), Respiratory syncytial virus (RSV), humant rhinovirus 14 og HCV
Legemiddelkliniske studier
Astma er preget av eosinofil-indusert betennelse motivert av en type 2 hjelper T-celle (Th2). Ved å målrette transkripsjonsfaktoren, GATA3, av Th2 -banen, med DNAzyme kan det være mulig å negere betennelsen. Sikkerheten og effekten av SB010, et nytt 10-23 DNA-enzym ble evaluert, og funnet å ha evnen til å spalte og inaktivere GATA3 messenger RNA i fase IIa kliniske studier. Behandling med SB010 kompenserte betydelig både sent og tidlig astmatisk respons etter allergenforverring hos mannlige pasienter med allergisk astma. Transkripsjonsfaktoren GATA-3 er også et interessant mål for den DNAzyme topiske formuleringen SB012, for en ny terapeutisk strategi for ulcerøs kolitt (UC). UC er en idiopatisk inflammatorisk tarmsykdom definert ved kronisk tilbakefall av betennelser i mage -tarmkanalen, og preget av en overfladisk, kontinuerlig slimhinnebetennelse, som hovedsakelig påvirker tykktarmen. Pasienter som ikke reagerer effektivt på gjeldende UC -behandlingsstrategier, viser alvorlige ulemper, hvorav den ene kan føre til kolorektal kirurgi, og kan resultere i alvorlig livskvalitet. Pasienter med moderat eller alvorlig UC kan dermed ha stor nytte av disse nye terapeutiske alternativene, hvorav SB012 er i fase I kliniske studier. Atopisk dermatitt (AD) er en kronisk inflammatorisk hudsykdom, der pasienter lider av eksem, ofte alvorlig kløe på den berørte huden, samt komplikasjoner og sekundære infeksjoner. AD overflater fra en oppregulering av Th2-modifiserte immunresponser, derfor er en ny AD-tilnærming ved bruk av DNA-enzymer rettet mot GATA-3 et sannsynlig behandlingsalternativ. Det aktuelle DNA -enzymet SB011 er for tiden i fase II kliniske studier. DNA -forskning for behandling av kreft pågår også. Utviklingen av et 10-23 DNA-enzym som kan blokkere ekspresjonen av IGF-I (insulinlignende vekstfaktor I, en bidragsyter til normal cellevekst så vel som tumorigenese) ved å målrette dets mRNA kan være nyttig for å blokkere sekresjonen av IGF- Jeg fra prostata storm primærceller som til slutt hemmer prostata svulst utvikling. I tillegg forventes det med denne behandlingen at hepatisk metastase også ville bli hemmet via hemming av IGF-I i leveren (den viktigste kilden til serum-IGF-I).
Sensorer
DNA -enzymer har funnet praktisk bruk i metallbiosensorer. En DNA -enzymbasert biosensor for blyion ble brukt til å oppdage blyion i vann på St. Paul Public Schools i Minnesota. Videre har DNA -enzymer blitt brukt i kombinasjon av aptamerer og nukleinsyrebioreceptorer for utvikling av en multiplex bioassay.
Asymmetrisk syntese
Kiralitet er en annen egenskap som et DNA -enzym kan utnytte. DNA forekommer i naturen som en høyrehendt dobbeltspiral, og ved asymmetrisk syntese er en kiral katalysator et verdifullt verktøy i syntesen av kirale molekyler fra en achiral kilde. I en applikasjon ble en kunstig DNA -katalysator fremstilt ved å feste et kobberion til den gjennom et avstandsstykke. Kobber -DNA -komplekset katalyserte en Diels -Alder -reaksjon i vann mellom cyklopentadien og en azakalkon. Reaksjonsproduktene (endo og exo) ble funnet å være tilstede i et enantiomert overskudd på 50%. Senere ble det funnet at et enantiomerisk overskudd på 99% kunne induseres, og at både hastigheten og enantioselektiviteten var relatert til DNA -sekvensen.
Andre bruksområder
Andre bruksområder av DNA i kjemi er i DNA- templert syntese , Enantioselektiv katalyse, DNA-nanotråder og DNA-databehandling .
Se også
Referanser
Eksterne linker
- Deoxyribozyme ved US National Library of Medicine Medical Subject Headings (MeSH)