Ionekromatografi - Ion chromatography

Et moderne ionekromatografisystem

Ionekromatografi (eller ionebytte- kromatografi ) separerer ioner og polare molekyler basert på deres affinitet til ione- veksleren. Det fungerer på nesten alle slags ladede molekyler - inkludert store proteiner , små nukleotider og aminosyrer . Imidlertid må ionekromatografi gjøres under forhold som er en enhet fra det proteinets isoelektriske punkt .

De to typene ionekromatografi er anionbytter og kationbytter. Kationbytterkromatografi brukes når molekylet av interesse er positivt ladet. Molekylet er positivt ladet fordi pH for kromatografi er mindre enn pI (a / k / a pH (I)). I denne typen kromatografi er den stasjonære fasen negativt ladet og positivt ladede molekyler lastes for å tiltrekkes av den. Anionbytterkromatografi er når den stasjonære fasen er positivt ladede og negativt ladede molekyler (som betyr at pH for kromatografi er større enn pI) er belastet for å tiltrekkes av den. Det brukes ofte i proteinrensing, vannanalyse og kvalitetskontroll. De vannløselige og ladede molekylene slik som proteiner, aminosyrer og peptider binder til deler som er motsatt ladet ved å danne ionebindinger til den uoppløselige stasjonære fasen. Den ekvilibrerte stasjonære fasen består av en ioniserbar funksjonell gruppe der de målrettede molekylene i en blanding som skal skilles og kvantifiseres kan binde mens de går gjennom kolonnen - en kationisk stasjonær fase brukes til å skille anioner og en anionisk stasjonær fase brukes til å skille kationer. Kationbytterkromatografi brukes når de ønskede molekylene som skal skilles er kationer og anionbytterkromatografi brukes til å skille anioner. De bundne molekylene kan deretter elueres og samles ved anvendelse av et elueringsmiddel som inneholder anioner og kationer ved å kjøre høyere konsentrasjon av ioner gjennom kolonnen eller endre pH i kolonnen.

En av de viktigste fordelene ved bruk av ionekromatografi er bare en interaksjon involvert under separasjonen i motsetning til andre separasjonsteknikker; derfor kan ionekromatografi ha høyere matriksetoleranse. En annen fordel med ionebytte er forutsigbarheten til elueringsmønstre (basert på tilstedeværelsen av den ioniserbare gruppen). For eksempel når kationbytterkromatografi brukes, vil kationer eluere sist. I mellomtiden vil de negativt ladede molekylene eluere først. Imidlertid er det også ulemper involvert når du utfører ionebyttekromatografi, slik som konstant utvikling med teknikken som fører til inkonsekvensen fra kolonne til kolonne. En viktig begrensning på denne rensingsteknikken er at den er begrenset til ioniserbar gruppe.

Historie

Ionebytte kromatografi

Ionkromatografi har avansert gjennom opphopning av kunnskap i løpet av mange år. Fra og med 1947 brukte Spedding og Powell fortrengning av ionebyttekromatografi for separering av de sjeldne jordene. I tillegg viste de ionebytterseparasjonen av 14N og 15N isotoper i ammoniakk. På begynnelsen av 1950-tallet demonstrerte Kraus og Nelson bruken av mange analytiske metoder for metallioner avhengig av deres separasjon av klorid-, fluor-, nitrat- eller sulfatkomplekser ved anionkromatografi. Automatisk in-line deteksjon ble gradvis introdusert fra 1960 til 1980, samt nye kromatografiske metoder for metallion-separasjoner. En banebrytende metode fra Small, Stevens og Bauman hos Dow Chemical Co. utfoldet etableringen av den moderne ionekromatografien. Anioner og kationer kunne nå skilles effektivt med et system med undertrykt ledningsevnedeteksjon. I 1979 ble en metode for anionkromatografi med ikke-undertrykt konduktivitetsdeteksjon introdusert av Gjerde et al. Etter det i 1980, var en lignende metode for kationskromatografi.

Som et resultat startet en periode med ekstrem konkurranse innen IC-markedet, med tilhengere for både undertrykt og ikke-undertrykt ledningsevnedeteksjon. Denne konkurransen førte til rask vekst av nye former og rask utvikling av IC. En utfordring som må overvinnes i den fremtidige utviklingen av IC er utarbeidelsen av svært effektive monolitiske ionebytterkolonner, og å overvinne denne utfordringen vil være av stor betydning for utviklingen av IC.

Bommen av ionebyttekromatografi begynte først og fremst mellom 1935–1950 under andre verdenskrig, og det var gjennom " Manhattan-prosjektet " at applikasjoner og IC ble utvidet betydelig. Ionkromatografi ble opprinnelig introdusert av to engelske forskere, landbruket Sir Thompson og kjemiker JT Way. Verkene til Thompson og Way involverte virkningen av vannløselig gjødselsalter, ammoniumsulfat og kaliumklorid. Disse saltene kunne ikke lett utvinnes fra bakken på grunn av regnet. De utførte ionemetoder for å behandle leire med saltene, noe som resulterte i ekstraksjon av ammoniakk i tillegg til frigjøring av kalsium. Det var på femti- og sekstitallet at teoretiske modeller ble utviklet for IC for videre forståelse, og det var ikke før på syttitallet at kontinuerlige detektorer ble brukt, og banet vei for utviklingen fra lavtrykk til høyytelseskromatografi. Først i 1975 ble "ionekromatografi" etablert som et navn med henvisning til teknikkene, og ble deretter brukt som et navn for markedsføringsformål. I dag er IC viktig for å undersøke vandige systemer, for eksempel drikkevann. Det er en populær metode for å analysere anioniske elementer eller komplekser som hjelper til med å løse miljømessige relevante problemer. På samme måte har den også gode bruksområder i halvlederindustrien .

På grunn av de mange skillekolonnene, elueringssystemene og detektorene som er tilgjengelige, har kromatografi utviklet seg til å bli den viktigste metoden for ioneanalyse.

Da denne teknikken først ble utviklet, ble den primært brukt til vannbehandling. Siden 1935 manifesterte ionebyttekromatografi seg raskt til en av de mest utnyttede teknikkene, med prinsippene som ofte ble brukt på de fleste kjemiske felt, inkludert destillasjon, adsorpsjon og filtrering.

Prinsipp

Ionekromatogram som viser anionseparasjon

Ionbytterkromatografi skiller molekyler basert på deres respektive ladede grupper. Ionebytterkromatografi beholder analyttmolekyler molekyler på søylen basert på coulombisk (ionisk) interaksjoner. Ionebyttekromatografimatrisen består av positivt og negativt ladede ioner. I hovedsak gjennomgår molekyler elektrostatiske interaksjoner med motsatte ladninger på den stasjonære fasematrisen. Den stasjonære fasen består av en immobil matrise som inneholder ladede ioniserbare funksjonelle grupper eller ligander. Den stasjonære faseoverflaten viser ioniske funksjonelle grupper (RX) som samhandler med analytioner med motsatt ladning. For å oppnå elektronutralitet kobles disse inerte ladningene sammen med utskiftbare motsetninger i løsningen. Ioniserbare molekyler som skal renses konkurrerer med disse utskiftbare motionene for binding til de immobiliserte ladningene i den stasjonære fasen. Disse ioniserbare molekylene beholdes eller elueres basert på deres ladning. Til å begynne med vasker molekyler som ikke binder seg eller binder seg svakt til den stasjonære fasen. Endrede forhold er nødvendige for elueringen av molekylene som binder til den stasjonære fasen. Konsentrasjonen av de utskiftbare motiene, som konkurrerer med molekylene om binding, kan økes eller pH kan endres. En endring i pH påvirker ladningen på de spesifikke molekylene og endrer derfor binding. Molekylene begynner deretter å elueres ut basert på endringene i ladningen fra justeringene. Ytterligere slike justeringer kan brukes til å frigjøre proteinet av interesse. I tillegg kan konsentrasjonen av motioner gradvis varieres for å skille ioniserte molekyler. Denne typen eluering kalles gradienteluering. På den annen side kan trinneluering brukes hvor konsentrasjonen av motioner varieres i ett trinn. Denne typen kromatografi er videre delt inn i kationbytterkromatografi og anionbytterkromatografi . Positivt ladede molekyler binder seg til kationbytterharpikser mens negativt ladede molekyler binder til anionbytterharpikser. Den ioniske forbindelsen bestående av den kationiske arten M + og den anioniske arten B- kan beholdes ved den stasjonære fasen.

Kationbytterkromatografi beholder positivt ladede kationer fordi den stasjonære fasen viser en negativt ladet funksjonell gruppe:

${\ displaystyle {\ text {RX}} ^ {-} {\ text {C}} ^ {+} \, + \, {\ text {M}} ^ {+} \, {\ text {B}} ^ {-} \ rightleftarrows \, ​​{\ text {RX}} ^ {-} {\ text {M}} ^ {+} \, + \, {\ text {C}} ^ {+} \, + \ , {\ text {B}} ^ {-}}$

Anionbytterkromatografi beholder anioner ved hjelp av positivt ladet funksjonell gruppe:

${\ displaystyle {\ text {RX}} ^ {+} {\ text {A}} ^ {-} \, + \, {\ text {M}} ^ {+} \, {\ text {B}} ^ {-} \ rightleftarrows \, ​​{\ text {RX}} ^ {+} {\ text {B}} ^ {-} \, + \, {\ text {M}} ^ {+} \, + \ , {\ text {A}} ^ {-}}$

Merk at ionestyrken til enten C + eller A- i mobilfasen kan justeres for å forskyve likevektsposisjonen, og dermed retensjonstid.

Ionkromatogrammet viser et typisk kromatogram oppnådd med en anionbytterkolonne.

Fremgangsmåte

Før ionebyttekromatografi kan igangsettes, må den bli ekvilibrert. Den stasjonære fasen må bli ekvilibrert til visse krav som avhenger av eksperimentet du jobber med. Når de har blitt ekvilibrert, vil de ladede ionene i den stasjonære fasen være festet til de motsatte ladede utskiftbare ionene. Utskiftbare ioner som Cl- eller Na +. Deretter bør det velges en buffer der ønsket protein kan binde seg til. Etter ekvilibrering må kolonnen vaskes. Vaskefasen vil bidra til å eliminere alle urenheter som ikke binder seg til matrisen mens proteinet av interesse forblir avgrenset. Denne prøvebufferen må ha samme pH som bufferen som brukes til ekvilibrering for å binde de ønskede proteinene. Uladede proteiner vil bli eluert ut av kolonnen med samme hastighet som bufferen som strømmer gjennom kolonnen. Når prøven har blitt lagt på kolonnen og kolonnen er vasket med bufferen for å eluere alle ikke-ønskede proteiner, blir eluering utført for å eluere de ønskede proteiner som er bundet til matrisen. Bundet proteiner elueres ved å benytte en gradient av lineært økende saltkonsentrasjon. Med økende ionestyrke av bufferen vil saltionene konkurrere med de ønskede proteiner for å binde til ladede grupper på overflaten av mediet. Dette vil føre til at ønskede proteiner elueres ut av kolonnen. Proteiner som har lav nettolading vil bli eluert ut først etter hvert som saltkonsentrasjonen øker, slik at ionestyrken øker. Proteiner med høy nettolading vil trenge en høyere ionestyrke for at de skal elueres ut av kolonnen. Det er mulig å utføre ionebyttekromatografi i bulk, på tynne lag av medium slik som glass- eller plastplater belagt med et lag av ønsket stasjonær fase, eller i kromatografikolonner. Tynnsjiktskromatografi eller kolonnekromatografi deler likheter ved at de begge handler innenfor de samme styrende prinsippene; det er konstant og hyppig utveksling av molekyler når den mobile fasen beveger seg langs den stasjonære fasen. Det er ikke viktig å legge til prøven i små volumer ettersom de forhåndsbestemte forholdene for utvekslingskolonnen er valgt slik at det vil være sterk interaksjon mellom den mobile og stasjonære fasen. Videre vil mekanismen for elueringsprosessen forårsake en oppdeling av de forskjellige molekylene basert på deres respektive kjemiske egenskaper. Dette fenomenet skyldes en økning i saltkonsentrasjoner på eller nær toppen av kolonnen, og derved forskyver molekylene i den posisjonen, mens molekyler bundet lavere frigjøres på et senere tidspunkt når den høyere saltkonsentrasjonen når det området. Disse prinsippene er årsakene til at ionebyttekromatografi er en utmerket kandidat for innledende kromatografitrinn i en kompleks rensingsprosedyre, da det raskt kan gi små volum målmolekyler uavhengig av større startvolum.

Kammer (til venstre) inneholder høy saltkonsentrasjon. Omrørt kammer (til høyre) inneholder lav saltkonsentrasjon. Gradvis omrøring forårsaker dannelsen av en saltgradient ettersom salt beveger seg fra høye til lave konsentrasjoner.

Sammenlignende enkle innretninger brukes ofte til å påføre motioner av økende gradient til en kromatografikolonne. Motverk som kobber (II) velges oftest for å effektivt separere peptider og aminosyrer gjennom kompleksdannelse.

En enkel enhet kan brukes til å lage en saltgradient. Elueringsbuffer trekkes konsekvent fra kammeret inn i blandekammeret, og derved endres bufferkonsentrasjonen. Generelt har bufferen som er plassert i kammeret vanligvis høy initial konsentrasjon, mens bufferen som er plassert i det omrørte kammeret vanligvis har lav konsentrasjon. Når høykonsentrasjonsbufferen fra venstre kammer blandes og trekkes inn i kolonnen, øker bufferkonsentrasjonen av den omrørte kolonnen gradvis. Endring av formene på det omrørte kammeret, samt grensebufferen, muliggjør produksjon av konkave, lineære eller konvekse graderinger av motion.

Et mangfold av forskjellige medier brukes til den stasjonære fasen. Blant de vanligste immobiliserte ladede gruppene som brukes er trimetylaminoetyl (TAM), trietylaminoetyl (TEAE), dietyl-2-hydroksypropylaminoetyl (QAE), aminoetyl (AE), dietylaminoetyl (DEAE), sulfo (S), sulfometyl (SM), sulfopropyl ( SP), karboksy (C) og karboksymetyl (CM).

Vellykket pakking av kolonnen er et viktig aspekt av ionekromatografi. Stabiliteten og effektiviteten til en sluttkolonne avhenger av pakkemetoder, løsningsmiddel som brukes, og faktorer som påvirker kolonnens mekaniske egenskaper. I motsetning til tidlig ineffektive tørrpakningsmetoder, viser våt oppslemmingspakking, hvor partikler som er suspendert i et passende løsningsmiddel, blir levert i en kolonne under trykk, betydelig forbedring. Tre forskjellige tilnærminger kan brukes ved utføring av våt oppslemmingspakking: metoden med balansert tetthet (løsemiddeldensiteten er omtrent den for porøse silikapartikler), metoden med høy viskositet (et løsningsmiddel med høy viskositet brukes), og metoden med lav viskositet (utført med løsemiddel med lav viskositet).

Polystyren brukes som medium for ionebytte. Den er laget av polymerisering av styren ved bruk av divinylbenzen og benzoylperoksid. Slike vekslere danner hydrofobe interaksjoner med proteiner som kan være irreversible. På grunn av denne egenskapen er polystyrenionbyttere ikke egnet for proteinseparasjon. De brukes derimot til separering av små molekyler i aminosyreseparasjon og fjerning av salt fra vann. Polystyrenionbyttere med store porer kan brukes til separering av protein, men må belegges med et hydrofilt stoff.

Cellulosebasert medium kan brukes til separering av store molekyler ettersom de inneholder store porer. Proteinbinding i dette mediet er høy og har lav hydrofob karakter. DEAE er en anionbyttermatrise som produseres fra en positiv sidegruppe av dietylaminoetyl bundet til cellulose eller Sephadex.

Agarosegelbasert medium inneholder også store porer, men deres substitusjonsevne er lavere sammenlignet med dekstraner. Mediumets evne til å svelle i væske er basert på tverrbinding av disse stoffene, pH og ionekonsentrasjonen av bufferne som brukes.

Inkorporering av høy temperatur og trykk tillater en betydelig økning i effektiviteten av ionekromatografi, sammen med en reduksjon i tiden. Temperatur har innflytelse på selektivitet på grunn av dens effekter på retensjonsegenskaper. Retensjonsfaktoren ( k = ( t _R ^g - t _M ^g ) / ( t _M ^g - t _ext )) øker med temperaturen for små ioner, og motsatt trend observeres for større ioner.

Til tross for ioneselektivitet i forskjellige medier, forskes det videre på å utføre ionebyttekromatografi i området 40–175 ° C.

Et passende løsemiddel kan velges basert på observasjoner av hvordan kolonnepartikler oppfører seg i et løsningsmiddel. Ved hjelp av et optisk mikroskop kan man enkelt skille en ønskelig spredt tilstand av oppslemming fra aggregerte partikler.

Svake og sterke ionebyttere

En "sterk" ionveksler vil ikke miste ladningen på matrisen når kolonnen er ekvilibrert, og et bredt spekter av pH-buffere kan brukes. "Svake" ionebyttere har en rekke pH-verdier der de vil opprettholde ladningen. Hvis pH-verdien til bufferen som brukes til en svak ionebyttekolonne, går utenfor kapasiteten til matrisen, vil kolonnen miste ladningsfordelingen, og molekylet av interesse kan gå tapt. Til tross for det mindre pH-området for svake ionebyttere, brukes de ofte over sterke ionebyttere på grunn av at de har større spesifisitet. I noen eksperimenter er retensjonstiden for svake ionebyttere akkurat lang nok til å oppnå ønsket data med høy spesifisitet.

Harpikser (ofte kalt "perler") i ionebyttekolonner kan omfatte funksjonelle grupper som svake / sterke syrer og svake / sterke baser. Det er også spesielle kolonner som har harpikser med amfotere funksjonelle grupper som kan utveksle både kationer og anioner. Noen eksempler på funksjonelle grupper av sterke ionebytterharpikser er kvaternært ammonium-kation (Q), som er en anionbytter, og sulfonsyre (S, -SO ₂ OH), som er en kationbytter. Disse typene vekslere kan opprettholde ladetettheten over et pH-område på 0–14. Eksempler på funksjonelle grupper med svak ionebytter-harpikser omfatter dietylaminoetyl (DEAE, -C ₂ H ₄ N- (CH ₂ H ₅ ) ₂ ), som er en anionbytter, og karboksymetyl (CM, -CH ₂ -COOH), som er en kationveksler. Disse to typene veksler kan opprettholde ladetettheten til kolonnene sine over et pH-område på 5–9.

I ionkromatografi bestemmer samspillet mellom de oppløste ionene og den stasjonære fasen basert på deres ladninger hvilke ioner som vil binde og i hvilken grad. Når den stasjonære fasen har positive grupper som tiltrekker seg anioner, kalles den en anionveksler; når det er negative grupper på den stasjonære fasen, tiltrekkes kationer og det er en kationveksler. Tiltrekningen mellom ioner og stasjonær fase avhenger også av harpiks, organiske partikler som brukes som ionebytter.

Hver harpiks har relativ selektivitet som varierer basert på de oppløste ioner som vil konkurrere om å binde seg til harpiksgruppen i den stasjonære fasen. Selektivitetskoeffisienten, ekvivalent med likevektskonstanten, bestemmes via et forhold mellom konsentrasjonene mellom harpiksen og hvert ion, men den generelle trenden er at ionebyttere foretrekker å binde seg til ionet med en høyere ladning, mindre hydratisert radius, og høyere polariserbarhet, eller muligheten for at elektronskyen til et ion forstyrres av andre ladninger. Til tross for denne selektiviteten, ville overskytende mengder av et ion med en lavere selektivitet introdusert i kolonnen føre til at det mindre ionet binder mer til den stasjonære fasen da selektivitetskoeffisienten tillater svingninger i bindingsreaksjonen som finner sted under ionebyttekromatografi.

Følgende tabell viser de vanligste ionebytterne

Typisk teknikk

En prøve introduseres, enten manuelt eller med en autosampler , i en prøveløkke med kjent volum. En bufret vandig løsning kjent som den mobile fasen fører prøven fra løkken til en kolonne som inneholder en eller annen form for stasjonær fasemateriale. Dette er typisk en harpiks eller gelmatrise som består av agarose- eller cellulosekuler med kovalent bundet, ladede funksjonelle grupper. Ekvilibrering av den stasjonære fasen er nødvendig for å oppnå ønsket ladning av kolonnen. Hvis kolonnen ikke er riktig ekvilibrert, kan det hende at ønsket molekyl ikke binder seg sterkt til kolonnen. Målanalytene (anioner eller kationer) beholdes på den stasjonære fasen, men kan elueres ved å øke konsentrasjonen av en lignende ladet art som fortrenger analytionene fra den stasjonære fasen. For eksempel i kationbytterkromatografi kan den positivt ladede analytten forskyves ved å tilsette positivt ladede natriumioner. Analysene av interesse må da oppdages på noen måter, vanligvis ved ledningsevne eller UV / synlig lysabsorbans.

Styring av et IC-system krever vanligvis et kromatografidatasystem (CDS). I tillegg til IC-systemer kan noen av disse CDS-ene også kontrollere gasskromatografi (GC) og HPLC.

Membranutvekslingskromatografi

En type ionebyttekromatografi, membranutveksling, er en relativt ny rensemetode designet for å overvinne begrensningene ved bruk av kolonner pakket med perler. Membrankromatografiske enheter er billige å masseprodusere og disponerer i motsetning til andre kromatografianordninger som krever vedlikehold og tid til å validere. Det er tre typer membranabsorbatorer som vanligvis brukes når du skiller stoffer. De tre typene er flate ark, hul fiber og radiell strømning. Den vanligste absorberen og best egnet for membrankromatografi er flere flate ark fordi den har mer absorberende volum. Den kan brukes til å overvinne begrensninger for masseoverføring og trykkfall, noe som gjør det spesielt fordelaktig for isolering og rensing av virus, plasmid-DNA og andre store makromolekyler. Kolonnen er fullpakket med mikroporøse membraner med indre porer som inneholder adsorptive deler som kan binde målproteinet. Adsorptive membraner er tilgjengelige i en rekke geometrier og kjemi som gjør at de kan brukes til rensing og også fraksjonering, konsentrasjon og avklaring i en effektivitet som er ti ganger så effektiv som ved bruk av perler. Membraner kan tilberedes gjennom isolering av selve membranen, der membraner blir kuttet i firkanter og immobilisert. En nyere metode involverte bruken av levende celler som er festet til en støttemembran og som brukes til identifisering og avklaring av signalmolekyler.

Separerende proteiner

Forberedende ionebyttekolonne som brukes til proteinrensing .

Ionbytterkromatografi kan brukes til å skille proteiner fordi de inneholder ladede funksjonelle grupper. Ionene av interesse (i dette tilfellet ladede proteiner) byttes mot andre ioner (vanligvis H ⁺ ) på en ladet fast bærer. Oppløste stoffer er oftest i en flytende fase, som har en tendens til å være vann. Ta for eksempel proteiner i vann, som vil være en flytende fase som føres gjennom en kolonne. Kolonnen er ofte kjent som den faste fasen siden den er fylt med porøse syntetiske partikler som har en bestemt ladning. Disse porøse partiklene blir også referert til som perler, kan amineres (inneholder aminogrupper) eller ha metallioner for å få en ladning. Kolonnen kan fremstilles ved hjelp av porøse polymerer, for makromolekyler over 100.000 er den optimale størrelsen på den porøse partikkelen ca. 1 um ² . Dette er fordi langsom diffusjon av de oppløste stoffene i porene ikke begrenser separasjonskvaliteten. Perlene som inneholder positivt ladede grupper, som tiltrekker seg de negativt ladede proteinene, blir ofte referert til som anionbytterharpikser. Aminosyrene som har negativt ladede sidekjeder ved pH 7 (pH i vann) er glutamat og aspartat. Perlene som er negativt ladede kalles kationbytterharpikser, da positivt ladede proteiner vil tiltrekkes. Aminosyrene som har positivt ladede sidekjeder ved pH 7 er lysin, histidin og arginin.

Det isoelektriske punktet er pH-verdien der en forbindelse - i dette tilfellet et protein - ikke har nettolading. Et proteins isoelektriske punkt eller PI kan bestemmes ved hjelp av pKa i sidekjedene. Hvis amino (positiv kjede) er i stand til å avbryte karboksyl (negativ) kjede, ville proteinet være ved PI. Å bruke buffere i stedet for vann til proteiner som ikke har en ladning ved pH 7, er en god ide da det gjør det mulig å manipulere pH for å endre ioniske interaksjoner mellom proteinene og perlene. Svakt sure eller basiske sidekjeder er i stand til å lade hvis pH er henholdsvis høy eller lav nok. Separasjon kan oppnås basert på proteinets naturlige isoelektriske punkt. Alternativt kan et peptidmerke tilsettes genetisk til proteinet for å gi proteinet et isoelektrisk punkt borte fra de fleste naturlige proteiner (f.eks. 6 argininer for binding til en kationbytterharpiks eller 6 glutamater for binding til en anionbytterharpiks som DEAE -Sepharose).

Eluering ved å øke ionestyrken i mobilfasen er mer subtil. Det fungerer fordi ioner fra den mobile fasen samhandler med de immobiliserte ionene på den stasjonære fasen, og dermed "skjermer" den stasjonære fasen fra proteinet, og lar proteinet elueres.

Eluering fra ione-utvekslingskolonner kan være sensitive overfor endringer i en enkelt lade- kromatofokusering . Ionebytte kromatografi er også nyttig i isolasjonen av spesifikke multimeriske proteinkonstruksjoner, noe som tillater rensing av spesifikke komplekser i henhold til både antall og posisjon av ladede peptidmerker.

Gibbs – Donnan-effekt

Ved ionebyttekromatografi observeres Gibbs – Donnan-effekten når pH-verdien til den påførte bufferen og ionebytter er forskjellig, til og med opp til en pH-enhet. For eksempel, i anionbytterkolonner, opphever ionebytterne protoner, slik at pH i bufferen nær kolonnen er forskjellig, er høyere enn resten av løsningsmidlet. Som et resultat må en eksperimentator være forsiktig med at proteinet (proteinene) av interesse er stabilt og riktig ladet i den "faktiske" pH.

Denne effekten kommer som et resultat av at to lignende ladede partikler, en fra harpiksen og en fra løsningen, ikke klarer å distribuere riktig mellom de to sidene; det er et selektivt opptak av ett ion over et annet. For eksempel, i en sulfonert polystyrenharpiks, en kationbytterharpiks, bør klorionet av en saltsyrebuffer ekvilibrere inn i harpiksen. Men siden konsentrasjonen av sulfonsyren i harpiksen er høy, har hydrogen av HCl ingen tendens til å komme inn i kolonnen. Dette, kombinert med behovet for elektronutralitet, fører til at en minimumsmengde av hydrogen og klor kommer inn i harpiksen.

Bruker

Klinisk nytte

En bruk av ionekromatografi kan sees i argentasjonskromatografi . Vanligvis har sølv og forbindelser som inneholder acetyleniske og etyleniske bindinger veldig svake interaksjoner. Dette fenomenet har blitt testet mye på olefinforbindelser. Ionkompleksene olefinene lager med sølvioner er svake og laget basert på overlappingen av pi, sigma og d orbitaler og tilgjengelige elektroner forårsaker derfor ingen reelle endringer i dobbeltbindingen. Denne oppførselen ble manipulert for å skille lipider, hovedsakelig fettsyrer fra blandinger til fraksjoner med forskjellige antall dobbeltbindinger ved bruk av sølvioner. Ionharpikser ble impregnert med sølvioner, som deretter ble utsatt for forskjellige syrer (kiselsyre) for å eluere fettsyrer med forskjellige egenskaper.

Deteksjonsgrenser så lave som 1 uM kan oppnås for alkalimetallioner. Den kan brukes til måling av HbA1c , porfyrin og med vannrensing . Ion Exchange Resins (IER) har blitt brukt mye, spesielt i medisiner på grunn av dens høye kapasitet og det ukompliserte systemet for separasjonsprosessen. En av de syntetiske bruksområdene er å bruke Ion Exchange Resins til nyredialyse. Denne metoden brukes til å skille blodelementene ved å bruke cellulosemembranert kunstig nyre.

En annen klinisk anvendelse av ionekromatografi er i hurtiganionbytterkromatografiteknikken som brukes til å skille kreatinkinase (CK) isoenzymer fra humant serum og vev hentet fra obduksjonsmateriale (for det meste ble CK-rikt vev brukt som hjertemuskel og hjerne). Disse isoenzymer inkluderer MM, MB og BB, som alle utfører samme funksjon gitt forskjellige aminosyresekvenser. Funksjonene til disse isoenzymer er å omdanne kreatin, ved hjelp av ATP, til fosfokreatin som utviser ADP. Minikolonner ble fylt med DEAE-Sephadex A-50 og videre eluert med tris-buffer natriumklorid i forskjellige konsentrasjoner (hver konsentrasjon ble med fordel valgt for å manipulere eluering). Humant vevsekstrakt ble satt inn i kolonner for separasjon. Alle fraksjoner ble analysert for å se total CK-aktivitet, og det ble funnet at hver kilde til CK-isoenzymer hadde karakteristiske isoenzymer funnet innenfor. For det første ble CK-MM eluert, deretter CK-MB, etterfulgt av CK-BB. Derfor kan isoenzymer som finnes i hver prøve brukes til å identifisere kilden, ettersom de var vevsspesifikke.

Ved å bruke informasjonen fra resultatene, kan det gjøres korrelasjon om diagnosen av pasienter og hva slags CK-isoenzymer som finnes i den mest utbredte aktiviteten. Fra funnet, om lag 35 av 71 studerte pasienter led av hjerteinfarkt (hjerteinfarkt) inneholdt også en rikelig mengde CK-MM og CK-MB isoenzymer. Funn viser videre at mange andre diagnoser, inkludert nyresvikt, cerebrovaskulær sykdom og lungesykdom, bare ble funnet å ha CK-MM-isoenzym og ikke noe annet isoenzym. Resultatene fra denne studien indikerer sammenhenger mellom ulike sykdommer og CK-isoenzymer funnet som bekrefter tidligere testresultater ved hjelp av forskjellige teknikker. Studier om CK-MB funnet hos ofre for hjerteinfarkt har utvidet seg siden denne studien og anvendelsen av ionekromatografi.

Industrielle applikasjoner

Siden 1975 har ionekromatografi blitt mye brukt i mange bransjer. De viktigste fordelene er pålitelighet, veldig god nøyaktighet og presisjon, høy selektivitet, høy hastighet, høy separasjonseffektivitet og lave kostnader til forbruksvarer. Den viktigste utviklingen relatert til ionekromatografi er nye prøvefremstillingsmetoder; forbedre hastigheten og selektiviteten til analyttseparasjon; senking av deteksjonsgrenser og kvantifiseringsgrenser; utvide anvendelsesområdet; utvikling av nye standardmetoder; miniatyrisering og utvidelse av omfanget av analysen av en ny gruppe stoffer. Tillater kvantitativ testing av elektrolytt og proprietære tilsetningsstoffer i galvaniseringsbad . Det er en fremgang av kvalitativ skrogcelletest eller mindre nøyaktig UV-testing. Ioner, katalysatorer, lysemidler og akseleratorer kan måles. Ionbytterkromatografi har gradvis blitt en allment kjent, universell teknikk for påvisning av både anioniske og kationiske arter. Applikasjoner for slike formål er utviklet, eller er under utvikling, for en rekke interessefelt, og spesielt farmasøytisk industri. Bruken av ionebyttekromatografi i legemidler har økt de siste årene, og i 2006 ble et kapittel om ionebyttekromatografi offisielt lagt til United States Pharmacopia- National Formulary (USP-NF). Videre, i 2009-utgivelsen av USP-NF, gjorde United States Pharmacopia flere analyser av ionekromatografi tilgjengelig ved bruk av to teknikker: deteksjon av ledningsevne, så vel som pulserende amperometrisk deteksjon. Flertallet av disse applikasjonene brukes primært til måling og analyse av restgrenser i farmasøytiske produkter, inkludert påvisning av grensene for oksalat, jodid, sulfat, sulfamat, fosfat, samt forskjellige elektrolytter, inkludert kalium og natrium. Totalt utgav 2009-utgaven av USP-NF offisielt tjueåtte påvisningsmetoder for analyse av aktive forbindelser, eller komponenter av aktive forbindelser, ved hjelp av enten ledningsevnedeteksjon eller puls amperometrisk deteksjon.

Legemiddelutvikling

Et ionekromatografisystem som brukes til å oppdage og måle kationer som natrium, ammonium og kalium i slimløsende hosteformuleringer.

Det har vært en økende interesse for anvendelse av IC i analysen av farmasøytiske legemidler. IC brukes i forskjellige aspekter av produktutvikling og kvalitetskontrolltesting. For eksempel brukes IC for å forbedre stabiliteten og løselighetsegenskapene til farmasøytiske aktive medikamenter, samt brukes til å oppdage systemer som har høyere toleranse for organiske løsningsmidler. IC har blitt brukt til bestemmelse av analytter som en del av en oppløsningstest. For eksempel har kalsiumoppløsningstester vist at andre ioner som er tilstede i mediet kan løses godt innbyrdes og også fra kalsiumionen. Derfor har IC blitt brukt i medikamenter i form av tabletter og kapsler for å bestemme mengden medikament oppløst med tiden. IC brukes også mye for påvisning og kvantifisering av hjelpestoffer eller inaktive ingredienser som brukes i farmasøytiske formuleringer. Påvisning av sukker og sukkeralkohol i slike formuleringer gjennom IC har blitt gjort på grunn av at disse polare gruppene blir løst i ionesøylen. IC-metodikk ble også etablert i analyse av urenheter i medikamentstoffer og produkter. Urenheter eller komponenter som ikke er en del av den kjemiske stoffet vurderes, og de gir innsikt i maksimale og minimale mengder medikament som skal administreres til en pasient per dag.

Se også

• Anion-bytte kromatografi
• Kromatofokusering
• Væskekromatografi med høy ytelse
• Isoelektrisk punkt

Referanser

Bibliografi

• Small, Hamish (1989). Ionekromatografi . New York: Plenum Press. ISBN 978-0-306-43290-3.
• Tatjana Weiss; Weiss, Joachim (2005). Håndbok for ionekromatografi . Weinheim: Wiley-VCH. ISBN 978-3-527-28701-7.
• Gjerde, Douglas T .; Fritz, James S. (2000). Ionekromatografi . Weinheim: Wiley-VCH. ISBN 978-3-527-29914-0.
• Jackson, Peter; Haddad, Paul R. (1990). Ionkromatografi: prinsipper og anvendelser . Amsterdam: Elsevier. ISBN 978-0-444-88232-5.
• Mercer, Donald W (1974). "Separasjon av vev og serumkreatinkinase-isoenzymer ved ionebyttekolonnekromatografi" . Klinisk kjemi . 20 (1): 36–40. doi : 10.1093 / clinchem / 20.1.36 . PMID  4809470 .
• Morris, LJ (1966). "Separasjoner av lipider ved sølvionskromatografi" . Journal of Lipid Research . 7 (6): 717–732. doi : 10.1016 / S0022-2275 (20) 38948-3 . PMID  5339485 .
• Ghosh, Raja (2002). "Proteinseparasjon ved bruk av membrankromatografi: muligheter og utfordringer". Journal of Chromatography A . 952 (1): 13–27. doi : 10.1016 / s0021-9673 (02) 00057-2 . PMID  12064524 .

Eksterne linker

• Media relatert til ionekromatografi på Wikimedia Commons

• LC Instruments på Curlie