Kometanalyse - Comet assay

CaspLab comet assay-skjermbilde

Den eneste celle gelelektroforese assay ( SCGE , også kjent som komet assay ) er et ukomplisert og følsom teknikk for påvisning av DNA-skade på nivået av den enkelte eukaryot celle . Den ble først utviklet av Östling & Johansson i 1984 og senere modifisert av Singh et al. i 1988. Den har siden økt i popularitet som en standardteknikk for evaluering av DNA-skade / reparasjon, bioovervåking og gentoksisitetstesting. Det involverer innkapsling av celler i en agarosesuspensjon med lavt smeltepunkt, lysering av cellene i nøytrale eller alkaliske forhold (pH> 13) og elektroforese av de suspenderte lyserte cellene. Uttrykket "komet" refererer til mønsteret for DNA-migrering gjennom elektroforesegel, som ofte ligner en komet.

Kometanalysen (encellet gelelektroforese) er en enkel metode for måling av deoksyribonukleinsyre (DNA) strengbrudd i eukaryote celler. Celler innebygd i agarose på et objektglass lyseres med vaskemiddel og høyt salt for å danne nukleoider som inneholder superviklede sløyfer av DNA knyttet til kjernematrisen. Elektroforese ved høy pH resulterer i strukturer som ligner kometer, observert ved fluorescensmikroskopi; intensiteten til komethalen i forhold til hodet gjenspeiler antall DNA-brudd. Det sannsynlige grunnlaget for dette er at sløyfer som inneholder et brudd, mister supercoiling og blir fritt til å strekke seg mot anoden. Dette blir fulgt av visuell analyse med flekker av DNA og beregning av fluorescens for å bestemme omfanget av DNA-skade. Dette kan utføres ved manuell scoring eller automatisk med bildeprogramvare.

Fremgangsmåte

Innkapsling

En prøve av celler, enten avledet fra en in vitro cellekultur eller fra en in vivo testperson, blir dispergert i individuelle celler og suspendert i smeltet agarose med lavt smeltepunkt ved 37 ° C. Denne monosuspensjonen er støpt på et objektglass . Et glass dekkglass holdes i en vinkel og monosuspensjonen påføres kontaktpunktet mellom dekkglasset og lysbildet. Når dekkglasset senkes på lysbildet sprer den smeltede agarosen seg for å danne et tynt lag. Agarosen er gelert ved 4 ° C og dekkglasset fjernet.

Agarosen danner en matrise av karbohydratfibre som innkapsler cellene, forankrer dem på plass. Agarosen anses å være osmotisk- nøytral, derfor kan løsninger trenge inn i gelen og påvirke cellene uten at celler skifter posisjon.

I en in vitro- studie vil cellene bli utsatt for et testmiddel - vanligvis UV-lys , ioniserende stråling eller et genotoksisk kjemikalie - for å indusere DNA-skade i de innkapslede cellene. For kalibrering , hydrogenperoksyd blir vanligvis brukt for å tilveiebringe et standardisert nivå av DNA-skade.

Lyse

Lysbildene senkes deretter ned i en løsning som får cellene til å lysere . Lyseringsløsningen som ofte brukes i kometanalysen består av et høyt konsentrert vandig salt (ofte kan vanlig bordsalt brukes) og et vaskemiddel (som Triton X-100 eller sarcosinate ). Lysoppløsningenes pH kan justeres (vanligvis mellom nøytral og alkalisk pH), avhengig av hvilken type skade forskeren undersøker.

Det vandige saltet forstyrrer proteiner og deres bindingsmønster i cellen, samt forstyrrer RNA- innholdet i cellen. Vaskemiddelet løser opp cellemembranene . Gjennom virkningen av lysisløsningen ødelegges cellene. Alle proteiner, RNA, membraner og cytoplasmatiske og nukleoplasmatiske bestanddeler forstyrres og diffunderer inn i agarosematrisen. Bare cellens DNA gjenstår, og ruller ut for å fylle hulrommet i agarosen som hele cellen tidligere fylte. Denne strukturen kalles nukleoid (et generelt begrep for en struktur der DNA er konsentrert).

Elektroforese

Etter lysering av cellene (typisk 1 til 2 timer ved 4 ° C) skyves lysbildene i destillert vann for å fjerne alle salter og senkes ned i en annen løsning - en elektroforeseoppløsning . Igjen kan denne løsningen justeres pH, avhengig av hvilken type skade som blir undersøkt.

Lysbildene blir liggende i ~ 20 minutter i elektroforeseoppløsningen før et elektrisk felt påføres. Under alkaliske betingelser den doble DNA-spiral blir denaturert og nucleoid blir enkelt-trådede.

Et elektrisk felt påføres (vanligvis 1 V / cm ) i ~ 20 minutter. Lysbildene nøytraliseres til pH 7, farges med en DNA-spesifikk fluorescerende flekk og analyseres ved hjelp av et mikroskop med en tilknyttet CCD ( ladekoblet enhet - i det vesentlige et digitalt kamera ) som er koblet til en datamaskin med programvare for bildeanalyse .

Bakgrunn

Konseptet som ligger til grunn for SCGE-analysen er at uskadet DNA beholder en høyt organisert tilknytning med matriksproteiner i kjernen. Når organisasjonen er skadet, blir den forstyrret. De enkelte DNA-strengene mister sin kompakte struktur og slapper av og utvider seg ut av hulrommet til agarosen. Når det elektriske feltet påføres, trekkes DNA, som har en total negativ ladning, mot den positivt ladede anoden. Ubeskadigede DNA-tråder er for store og forlater ikke hulrommet, mens jo mindre fragmentene er, desto lenger er de fri til å bevege seg i løpet av en gitt tidsperiode. Derfor er mengden DNA som forlater hulrommet et mål på mengden DNA-skade i cellen.

Bildeanalysen måler den totale intensiteten av fluorescensen for hele nukleoid og fluorescensen av det migrerte DNA og sammenligner de to signalene. Jo sterkere signalet fra det migrerte DNAet jo mer skade er det til stede. Den generelle strukturen ligner en komet (derav "kometanalyse") med et sirkulært hode som tilsvarer det uskadede DNA som er igjen i hulrommet og en hale av skadet DNA. Jo lysere og lenger halen er, desto høyere er skadenivået.

Kometanalysen er en allsidig teknikk for å oppdage skade og med justeringer av protokollen kan brukes til å kvantifisere tilstedeværelsen av et bredt utvalg av DNA-endrende lesjoner (skade). Skaden som vanligvis oppdages, er enkeltstrengsbrudd og dobbeltstrengsbrudd. Noen ganger blir det uttalt at alkaliske forhold og fullstendig denaturering av DNA er nødvendig for å oppdage enkeltstrengsbrudd. Dette er imidlertid ikke sant, både enkelt- og dobbeltstrengsbrudd oppdages også under nøytrale forhold. Under alkaliske forhold oppdages imidlertid ytterligere DNA-strukturer som DNA-skader: AP-steder (abasiske steder som mangler enten et pyrimidin eller purin- nukleotid ) og steder der eksisjonsreparasjon pågår.

Kometanalysen er en ekstremt sensitiv DNA-skadeanalyse. Denne følsomheten må håndteres forsiktig, da den også er sårbar for fysiske endringer som kan påvirke reproduserbarheten av resultatene. I det vesentlige skal alt som kan forårsake DNA-skade eller denaturering unntatt faktoren (e) som blir undersøkt, unngås. Den vanligste formen for analysen er den alkaliske versjonen, selv om det foreløpig ikke er noen endelig alkalisk analyseprotokoll. På grunn av det enkle og rimelige oppsettet kan den brukes under forhold der mer komplekse analyser ikke er tilgjengelige.

applikasjoner

Disse inkluderer gentoksisitetstesting, menneskelig bioovervåking og molekylær epidemiologi, økogenotoksikologi, samt grunnleggende forskning innen DNA-skade og reparasjon.

Sperm DNA-fragmentering

En kometanalyse kan bestemme graden av DNA-fragmentering i sædceller. Graden av DNA-fragmentering har vært assosiert med utfall av in vitro befruktning .

Kometen er modifisert for bruk med sædceller som et verktøy for mannlig infertilitetsdiagnose

For å bryte ned disse tettbundne protaminproteinene for å kunne bruke kometen til sædceller, kreves det ytterligere trinn i de-kondensasjonsprotokollen.

Referanser

  1. ^ Singh, Narendra P .; McCoy, Michael T .; Tice, Raymond R .; Schneider, Edward L. (1988-03-01). "En enkel teknikk for kvantifisering av lave nivåer av DNA-skade i individuelle celler" . Eksperimentell celleforskning . 175 (1): 184–191. doi : 10.1016 / 0014-4827 (88) 90265-0 . ISSN  0014-4827 .
  2. ^ Tice, RR (2000). "Single Cell Gel / Comet Assay: Guidelines for in vitro and in vivo Genetic Toxicology Testing" . Miljø- og molekylær mutagenese . 35 (3): 206–21. doi : 10.1002 / (SICI) 1098-2280 (2000) 35: 3 <206 :: AID-EM8> 3.0.CO; 2-J . PMID  10737956 .
  3. ^ Nandhakumar, S; Parasuraman, S; Shanmugam, MM; Rao, KR; Chand, P; Bhat, BV (2011). "Evaluering av DNA-skade ved bruk av encellede gelelektroforese (Comet Assay)" . J Pharmacol Pharmacother . 2 (2): 107–11. doi : 10.4103 / 0976-500X.81903 . PMC  3127337 . PMID  21772771 .
  4. ^ Collins, AR (mars 2004). "Kometanalysen for DNA-skade og reparasjon: prinsipper, applikasjoner og begrensninger" . Mol. Bioteknologi . 26 (3): 249–61. doi : 10.1385 / MB: 26: 3: 249 . PMID  15004294 . S2CID  34355649 .
  5. ^ Nandhakumar, S; Parasuraman, S; Shanmugam, MM; Rao, KR; Chand, P; Bhat, BV (apr. 2011). "Evaluering av DNA-skade ved bruk av encellede gelelektroforese (Comet Assay)" . J Pharmacol Pharmacother . 2 (2): 107–11. doi : 10.4103 / 0976-500X.81903 . PMC  3127337 . PMID  21772771 .
  6. ^ Pu, Xinzhu; Wang, Zemin; Klaunig, James E. (2015-08-06). "Alkaline Comet Assay for Assessing DNA Damage in Individual Cells". Nåværende protokoller i toksikologi . 65 : 3.12.1–11. doi : 10.1002 / 0471140856.tx0312s65 . ISBN 978-0471140856. ISSN  1934-9262 . PMID  26250399 . S2CID  6105193 .
  7. ^ Møller, Peter (april 2006). "Den alkaliske kometanalysen: mot validering i bioovervåking av DNA-skadelige eksponeringer" . Grunnleggende og klinisk farmakologi og toksikologi . 98 (4): 336–345. doi : 10.1111 / j.1742-7843.2006.pto_167.x . ISSN  1742-7835 . PMID  16623855 .
  8. ^ Belyaev, Igor Y; Eriksson, Stefan; Nygren, Jonas; Torudd, Jesper; Harms-Ringdahl, Mats (1999-08-05). "Effekter av ethidiumbromid på DNA-sløyfeorganisasjon i humane lymfocytter målt ved avvikende viskositets tidsavhengighet og enkeltcellelektroforese". Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Generelle emner . 1428 (2–3): 348–356. doi : 10.1016 / S0304-4165 (99) 00076-8 . ISSN  0304-4165 . PMID  10434054 .
  9. ^ Olive, PL; Banáth, JP; Durand, RE (april 1990). "Heterogenitet i strålingsindusert DNA-skade og reparasjon i tumor og normale celler målt ved hjelp av" komet "-analysen". Strålingsforskning . 122 (1): 86–94. Bibcode : 1990RadR..122 ... 86O . doi : 10.2307 / 3577587 . ISSN  0033-7587 . JSTOR  3577587 . PMID  2320728 .
  10. ^ Powell, S .; McMillan, TJ (1990-10-01). "DNA-skade og reparasjon etter behandling med ioniserende stråling" . Strålebehandling og onkologi . 19 (2): 95–108. doi : 10.1016 / 0167-8140 (90) 90123-E . ISSN  0167-8140 . PMID  2255771 .
  11. ^ Wojewódzka, Maria; Buraczewska, Iwona; Kruszewski, Marcin (2002-06-27). "En modifisert nøytral kometanalyse: eliminering av lysis ved høy temperatur og validering av analysen med anti-enkeltstrenget DNA-antistoff". Mutasjonsforskning . 518 (1): 9–20. doi : 10.1016 / s1383-5718 (02) 00070-0 . ISSN  0027-5107 . PMID  12063063 .
  12. ^ Collins, Andrew R (1997-04-29). "Kometanalysen: hva kan den egentlig fortelle oss?". Mutasjonsforskning / grunnleggende og molekylære mekanismer for mutagenese . 375 (2): 183–193. doi : 10.1016 / S0027-5107 (97) 00013-4 . ISSN  0027-5107 . PMID  9202728 .
  13. ^ Gedik, CM; Ewen, SW; Collins, AR (september 1992). "Encellet gelelektroforese anvendt på analysen av UV-C-skader og reparasjon i menneskelige celler". International Journal of Radiation Biology . 62 (3): 313–320. doi : 10.1080 / 09553009214552161 . ISSN  0955-3002 . PMID  1356133 .
  14. ^ Teoretiske og praktiske begrensninger for analysen er diskutert f.eks i Klaude et al. (1996) og Collins et al. (1997).
  15. ^ https://www2.le.ac.uk/departments/csmm/.../SCG%20Electrophoresis.pdf
  16. ^ Simon L, Brunborg G, Stevenson M, Lutton D, McManus J, Lewis SE (Mai 2010). "Klinisk betydning av sperm-DNA-skade i assistert reproduksjonsresultat" . Hum Reprod . 25 (7): 1594–1608. doi : 10.1093 / humrep / deq103 . PMID  20447937 .
  17. ^ Nagrajappa; Ganguly, Anutosh; Goswami, Usha (2006). "DNA-skade i mannlige gonadeceller av grønn blåskjell (Perna viridis) ved eksponering for tobakksprodukter". Økotoksikologi . 15 (4): 365–369. doi : 10.1007 / s10646-006-0077-1 . PMID  16673160 . S2CID  13956778 .
  18. ^ Hughes CM, Lewis SEM, McKelvey-Martin V, Thompson W. Reproduserbarhet av menneskelige sæd-DNA-målinger ved bruk av en enkeltcellelektroforeseanalyse. Mutasjonsforskning 1997 374: 261-268.
  19. ^ a b Donnelly, ET; McClure, N; Lewis, SEM (1999). "Effektene av tilskudd av askorbat og @ -tocopherol in vitro på DNA-integritet og hydrogenperoksidindusert DNA-skade i humane spermatozoer" . Mutagenese . 14 (5): 505–511. doi : 10.1093 / mutage / 14.5.505 . PMID  10473655 .
  20. ^ Ribas-Maynou Jordi, Agustı´n Garcı´a-Peiro´, Alba Fernandez-Encinas, Maria Jose´ Amengual og Benet Jordi, Double Stranded Sperm DNA Breaks, målt av Comet Assay, er assosiert med uforklarlig tilbakevendende spontanabort i par uten en Kvinnelig faktor

Videre lesning