DNA -fragmentering - DNA fragmentation

DNA -fragmentering er separering eller brytning av DNA -tråder i biter. Det kan gjøres med vilje av laboratoriepersonell eller av celler, eller kan forekomme spontant. Spontan eller tilfeldig DNA -fragmentering er fragmentering som gradvis akkumuleres i en celle. Den kan måles ved f.eks. Comet -analysen eller TUNEL -analysen .

Menn med sædmotilitetsdefekter har ofte høye nivåer av sæd DNA -fragmentering. Graden av DNA -fragmentering i sædceller kan forutsi utfall for in vitro -befruktning (IVF) og dens ekspansjon intracytoplasmatisk sædinjeksjon (ICSI). Den sperm kromatin dispersjon test (SCD) og TUNEL assay både er effektive i å oppdage sperm DNA-skade. Ved bruk av lysfeltmikroskopi ser det ut til at SCD-testen er mer sensitiv enn TUNEL-analysen.

Dens viktigste måleenheter er DNA Fragmentation Index (DFI). En DFI på 20% eller mer reduserer suksessratene betydelig etter ICSI.

DNA -fragmentering ble først dokumentert av Williamson i 1970 da han observerte diskrete oligomere fragmenter som forekom under celledød i primære nyfødte leverkulturer. Han beskrev det cytoplasmatiske DNA isolert fra museleverceller etter kultur som preget av DNA -fragmenter med en molekylvekt bestående av multipler på 135 kDa . Dette funnet var i samsvar med hypotesen om at disse DNA -fragmentene var et spesifikt nedbrytningsprodukt av kjernefysisk DNA.

Bevisst

DNA -fragmentering er ofte nødvendig før bibliotekskonstruksjon eller subkloning for DNA -sekvenser. En rekke metoder som involverer mekanisk brudd på DNA har blitt brukt der DNA er fragmentert av laboratoriepersonell. Slike metoder inkluderer sonikering, nålskjæring, forstøvning, skjæring av punkt-synk og passering gjennom en trykkcelle.

  • Restriksjonsfordøyelse er bevisst laboratoriebrudd av DNA -tråder. Det er en enzymbasert behandling som brukes i bioteknologi for å kutte DNA i mindre tråder for å studere forskjeller i fragmentlengde mellom individer eller for genkloning. Denne metoden fragmenterer DNA enten ved samtidig spaltning av begge tråder, eller ved generering av nicks på hver streng av dsDNA for å produsere dsDNA -brudd.
  • Akustisk skjæring av overføring av høyfrekvente akustiske energibølger levert til et DNA-bibliotek. Transduseren er skålformet slik at bølgene konvergerer ved målet av interesse.
  • Nebulisering tvinger DNA gjennom et lite hull i en forstøverenhet , noe som resulterer i dannelse av en fin tåke som samles opp. Fragmentstørrelse bestemmes av trykket i gassen som brukes til å skyve DNA gjennom forstøveren, hastigheten DNA -løsningen passerer gjennom hullet, løsningens viskositet og temperaturen.
  • Sonikering , en type hydrodynamisk skjæring, utsetter DNA for akustisk kavitasjon og hydrodynamisk skjæring ved eksponering for korte perioder med sonikering, noe som vanligvis resulterer i 700bp fragmenter. For DNA-fragmentering brukes ofte sonikering ved burst-sykluser ved bruk av sonikator av sonde-type.
  • Point-sink shearing, en type hydrodynamisk skjæring, bruker en sprøytepumpe for å lage hydrodynamiske skjærkrefter ved å skyve et DNA-bibliotek gjennom en liten brå sammentrekning. Omtrent 90% av fragmentlengdene faller innenfor et todelt område.
  • Nålskjæring skaper skjærkrefter ved å føre DNA -biblioteker gjennom en liten måler. DNA passerer gjennom en målerål flere ganger for fysisk å rive DNA i fine biter.
  • Franske trykkceller passerer DNA gjennom en smal ventil under høyt trykk for å skape høye skjærkrefter. Med en fransk presse kan skjærkraften moduleres nøye ved å justere stempeltrykket. Pressen gir en enkelt passering gjennom punktet for maksimal skjærkraft, og begrenser skader på delikate biologiske strukturer på grunn av gjentatt skjær, som forekommer i andre forstyrrelsesmetoder.
  • I transposomformidlet fragmentering (tagmentering) tilberedes transposomer med DNA som deretter kuttes slik at transposisjonshendelsene resulterer i fragmentert DNA med adaptere (i stedet for en innsetting). Den relative konsentrasjonen av transposomer og DNA må være passende.

Spontan

Apoptotisk DNA -fragmentering er en naturlig fragmentering som celler utfører ved apoptose (programmert celledød). DNA -fragmentering er et biokjemisk kjennetegn på apoptose . I døende celler spaltes DNA av en endonuklease som fragmenterer kromatinet til nukleosomale enheter, som er multipler av omtrent 180 bp oligomerer og vises som en DNA-stige når den kjøres på en agarosegel. Det enzym som er ansvarlig for apoptotisk DNA-fragmentering er Caspase-aktiverte DNase . CAD hemmes normalt av et annet protein, Inhibitor of Caspase Activated DNase (ICAD) . Under apoptose spaltes den apoptotiske effektor caspase, caspase 3, ICAD og får dermed CAD til å bli aktivert.

En DNA -dobbeltstreng viklet rundt en kjerne av histonproteiner
En nucleosome , bestående av DNA (grå) viklet rundt en histon tetramer (farget). Ved apoptotisk DNA -fragmentering spaltes DNA i den internukleosomale linkerregionen , som er den delen av DNA som ikke er viklet rundt histonene.

CAD spalter DNA på de internukleosomale linkerstedene mellom nukleosomene, proteinholdige strukturer som forekommer i kromatin med intervaller på ~ 180 bp. Dette er fordi DNA normalt er tett viklet rundt histoner, kjerneproteinene i nukleosomene. Linkerstedene er de eneste delene av DNA -strengen som er eksponert og dermed tilgjengelige for CAD.

Bruker

DNA -fragmentering spiller en viktig rolle i rettsmedisin, spesielt DNA -profilering .

  • Restriksjonsfragmentlengde Polymorfisme (RFLP) er en teknikk for å analysere de variable lengdene av DNA -fragmenter som oppstår ved å fordøye en DNA -prøve med en restriksjonsendonuklease . Restriksjonsendonukleasen kutter DNA ved et spesifikt sekvensmønster kjent som et restriksjonsendonuklease -gjenkjenningssted. Tilstedeværelse eller fravær av visse gjenkjennelsessteder i en DNA -prøve genererer variable lengder av DNA -fragmenter, som separeres ved hjelp av gelelektroforese . De hybridiseres deretter med DNA -prober som binder seg til en komplementær DNA -sekvens i prøven.
  • I polymerasekjedereaksjon (PCR) -analyse lages millioner av eksakte kopier av DNA fra en biologisk prøve. Den pleide å forsterke en bestemt region av en DNA -streng (DNA -målet). De fleste PCR -metoder amplifiserer vanligvis DNA -fragmenter på mellom 0,1 og 10 kilo basepar (kb), selv om noen teknikker tillater forsterkning av fragmenter på opptil 40 kb i størrelse. PCR bruker også varme for å skille DNA -trådene.
  • DNA fragmentert under apoptose, med en størrelse fra 1 til 20 nukleosomer, kan selektivt isoleres fra cellene fikset i denaturerende fiksativ etanol

Referanser