Denaturering (biokjemi) - Denaturation (biochemistry)
Prosess med delvis eller total endring av de native sekundære og/eller tertiære og/eller kvartære strukturer av proteiner eller nukleinsyrer som resulterer i tap av bioaktivitet .
Merknad 1 : Endret fra definisjonen gitt i ref.
Merknad 2 : Denaturering kan oppstå når proteiner og nukleinsyrer utsettes for forhøyet temperatur eller ekstreme pH -verdier, eller for ikke -fysiologiske konsentrasjoner av salt, organiske løsningsmidler, urea eller andre kjemiske midler.
Merknad 3 : Et enzym mister sin katalytiske aktivitet når det er denaturisert.
Denaturering er en prosess der proteiner eller nukleinsyrer mister den kvaternære strukturen , tertiære strukturen og den sekundære strukturen som er tilstede i sin opprinnelige tilstand , ved påføring av ekstern stress eller forbindelse som en sterk syre eller base , et konsentrert uorganisk salt, et organisk løsningsmiddel (f.eks. alkohol eller kloroform ), agitasjon og stråling eller varme . Hvis proteiner i en levende celle denatureres, resulterer dette i forstyrrelse av celleaktivitet og muligens celledød. Protein denaturering er også en konsekvens av celledød. Denaturerte proteiner kan oppvise et bredt spekter av egenskaper, fra konformasjonsendring og tap av løselighet til aggregering på grunn av eksponering av hydrofobe grupper. Denaturerte proteiner mister sin 3D -struktur og kan derfor ikke fungere.
Proteinfelling er nøkkelen til om et kule- eller membranprotein kan gjøre jobben sin riktig; den må brettes til riktig form for å fungere. Imidlertid er hydrogenbindinger , som spiller en stor rolle i folding, ganske svake og påvirkes dermed lett av varme, surhet, varierende saltkonsentrasjoner og andre stressorer som kan denaturere proteinet. Dette er en grunn til at homeostase er fysiologisk nødvendig i mange livsformer .
Dette konseptet er ikke relatert til denaturert alkohol , som er alkohol som har blitt blandet med tilsetningsstoffer for å gjøre det uegnet til konsum.
Vanlige eksempler
Når maten er tilberedt, blir noen av proteinene denaturert. Det er derfor kokte egg blir harde og kokt kjøtt blir fast.
Et klassisk eksempel på denaturering i proteiner kommer fra eggehviter, som vanligvis stort sett er eggalbuminer i vann. Eggehviten er fersk fra eggene og er gjennomsiktig og flytende. Tilberedning av de termisk ustabile hvite gjør dem ugjennomsiktige og danner en sammenhengende fast masse. Den samme transformasjonen kan utføres med et denaturerende kjemikalie. Helle eggehviter i et begerglass med aceton vil også gjøre eggehviten gjennomsiktig og solid. Huden som dannes på rørt melk er et annet vanlig eksempel på denaturert protein. Den kalde forretten kjent som ceviche tilberedes ved kjemisk "matlaging" av rå fisk og skalldyr i en sur sitrusmarinade, uten varme.
Protein denaturering
Denaturerte proteiner kan oppvise et bredt spekter av egenskaper, fra tap av løselighet til proteinaggregasjon .
1) Primær struktur: lineær struktur av aminosyrer i polypeptidkjeden
2) Sekundær struktur: hydrogenbindinger mellom peptidgruppekjeder i en alfa-helix eller beta-plate
3) Tertiær struktur: tredimensjonal struktur av alfa-helixer og beta-helixer brettet
4) Kvaternær struktur: tredimensjonal struktur av flere polypeptider og hvordan de passer sammen
Bakgrunn
Proteiner eller polypeptider er polymerer av aminosyrer . Et protein dannes av ribosomer som "leser" RNA som er kodet av kodoner i genet og samler den nødvendige aminosyrekombinasjonen fra den genetiske instruksjonen, i en prosess som kalles translation . Den nyopprettede proteinstrengen gjennomgår deretter posttranslasjonell modifikasjon , der ytterligere atomer eller molekyler tilsettes, for eksempel kobber , sink eller jern . Når denne post-translasjonelle modifikasjonsprosessen er fullført, begynner proteinet å brette seg (noen ganger spontant og noen ganger med enzymatisk hjelp), og krølle seg sammen slik at hydrofobe elementer i proteinet blir begravet dypt inne i strukturen og hydrofile elementer havner på utenfor. Den endelige formen på et protein bestemmer hvordan det samhandler med omgivelsene.
Proteinfolding består av en balanse mellom en betydelig mengde svake intra-molekylære interaksjoner i et protein (hydrofobe, elektrostatiske og Van Der Waals interaksjoner) og protein-løsningsmiddel interaksjoner. Som et resultat er denne prosessen sterkt avhengig av miljøtilstanden som proteinet befinner seg i. Disse miljøforholdene inkluderer, og er ikke begrenset til, temperatur , saltinnhold , trykk og løsningsmidler som tilfeldigvis er involvert. Følgelig kan enhver eksponering for ekstreme påkjenninger (f.eks. Varme eller stråling, høye uorganiske saltkonsentrasjoner, sterke syrer og baser) forstyrre et proteins interaksjon og uunngåelig føre til denaturering.
Når et protein denatureres, endres sekundære og tertiære strukturer, men peptidbindingen til den primære strukturen mellom aminosyrene forblir intakt. Siden alle strukturelle nivåer av proteinet bestemmer dets funksjon, kan proteinet ikke lenger utføre sin funksjon når det først er blitt denaturert. Dette er i motsetning til iboende ustrukturerte proteiner , som brettes ut i sin opprinnelige tilstand , men fortsatt er funksjonelt aktive og har en tendens til å brette seg ved binding til deres biologiske mål.
Hvordan denaturering oppstår på nivåer av proteinstruktur
- I denaturering i kvaternær struktur blir proteinesubenheter dissosiert og/eller det romlige arrangementet av proteinsubenheter blir forstyrret.
-
Denaturering av tertiær struktur innebærer forstyrrelse av:
- Kovalente interaksjoner mellom aminosyre- sidekjeder (for eksempel disulfidbroer mellom cystein- grupper)
- Ikke-kovalente dipol -
- Van der Waals (indusert dipol) interaksjoner mellom upolare aminosyresidekjeder.
Tap av funksjon
De fleste biologiske substrater mister sin biologiske funksjon når denatureres. For eksempel mister enzymer sin aktivitet fordi substratene ikke lenger kan binde seg til det aktive stedet , og fordi aminosyrerester som er involvert i stabilisering av substraters overgangstilstander ikke lenger er posisjonert for å kunne gjøre det. Denatureringsprosessen og det tilhørende tapet av aktivitet kan måles ved hjelp av teknikker som dual-polarisering interferometri , CD , QCM-D og MP-SPR .
Tap av aktivitet på grunn av tungmetaller og metalloider
Ved å målrette proteiner har tungmetaller vært kjent for å forstyrre funksjonen og aktiviteten som utføres av proteiner. Det er viktig å merke seg at tungmetaller faller inn i kategorier som består av overgangsmetaller samt en valgt mengde metalloid. Disse metallene har en tendens til å spille en rolle i å hindre deres biologiske aktivitet når de interagerer med native, brettede proteiner. Denne interferensen kan utføres på forskjellige måter. Disse tungmetallene kan danne et kompleks med de funksjonelle sidekjedegruppene som er tilstede i et protein eller danne bindinger til frie tioler. Tungmetaller spiller også en rolle i oksiderende aminosyresidekjeder som er tilstede i protein. Sammen med dette, når det samhandler med metalloproteiner, kan tungmetaller forflytte seg og erstatte viktige metallioner. Som et resultat kan tungmetaller forstyrre brettede proteiner, noe som sterkt kan avskrekke proteinstabilitet og aktivitet.
Reversibilitet og irreversibilitet
I mange tilfeller er denaturering reversibel (proteinene kan gjenvinne sin opprinnelige tilstand når denaturerende påvirkning er fjernet). Denne prosessen kan kalles renaturering. Denne forståelsen har ført til forestillingen om at all informasjon som trengs for at proteiner skal anta sin opprinnelige tilstand, er kodet i proteinets primære struktur, og dermed i DNA som koder for proteinet, den såkalte " Anfinsens termodynamiske hypotese ".
Denaturering kan også være irreversibel. Denne irreversibiliteten er vanligvis en kinetisk, ikke termodynamisk irreversibilitet, da et brettet protein generelt har lavere ledig energi enn når det brettes ut. Gjennom kinetisk irreversibilitet kan det faktum at proteinet sitter fast i et lokalt minimum, stoppe det fra å noen gang foldes tilbake etter at det har blitt irreversibelt denaturert.
Protein denaturering på grunn av pH
Denaturering kan også skyldes endringer i pH -verdien som kan påvirke aminosyrernes kjemi og restene av dem. De ioniserbare gruppene i aminosyrer er i stand til å bli ioniserte når endringer i pH oppstår. En pH -endring til surere eller mer grunnleggende forhold kan forårsake utfoldelse. Syreindusert utfoldelse skjer ofte mellom pH 2 og 5, baseindusert utfoldelse krever vanligvis pH 10 eller høyere.
Nukleinsyre denaturering
Nukleinsyrer (inkludert RNA og DNA ) er nukleotidpolymerer syntetisert av polymeraseenzymer under enten transkripsjon eller DNA -replikasjon . Etter 5'-3'-syntese av ryggraden, er individuelle nitrogenholdige baser i stand til å samhandle med hverandre via hydrogenbinding , og dermed muliggjøre dannelse av strukturer av høyere orden. Nukleinsyredaturering oppstår når hydrogenbinding mellom nukleotider blir forstyrret, og resulterer i separasjon av tidligere glødede tråder. For eksempel resulterer denaturering av DNA på grunn av høye temperaturer i forstyrrelsen av Watson og Crick -basepar og separasjonen av den dobbeltstrengede helixen i to enkelttråder. Nukleinsyrestrenger er i stand til å annealere på nytt når " normale " forhold blir gjenopprettet, men hvis restaurering skjer for raskt, kan nukleinsyrestrenge annealere ufullstendig og resultere i feil sammenkobling av baser.
Biologisk indusert denaturering
De ikke-kovalente interaksjonene mellom antiparallelle tråder i DNA kan brytes for å "åpne" den dobbelte helixen når biologisk viktige mekanismer som DNA-replikasjon, transkripsjon, DNA-reparasjon eller proteinbinding skal skje. Området med delvis atskilt DNA er kjent som denatureringsboblen, som mer spesifikt kan defineres som åpningen av en DNA dobbel helix gjennom den koordinerte separasjonen av basepar.
Den første modellen som forsøkte å beskrive termodynamikken til denatureringsboblen ble introdusert i 1966 og ble kalt Polen-Scheraga-modellen. Denne modellen beskriver denaturering av DNA -tråder som en funksjon av temperaturen . Etter hvert som temperaturen øker, blir hydrogenbindingene mellom Watson og Crick basepar forstyrret i økende grad og "denaturerte sløyfer" begynner å danne. Imidlertid anses Polen-Scheraga-modellen nå som elementær fordi den ikke klarer å ta hensyn til de forvirrende implikasjonene av DNA-sekvens , kjemisk sammensetning, stivhet og vridning .
Nyere termodynamiske studier har konkludert med at levetiden til en enkelt denatureringsboble varierer fra 1 mikrosekund til 1 millisekund. Denne informasjonen er basert på etablerte tidsskalaer for DNA -replikasjon og transkripsjon. For tiden utføres biofysiske og biokjemiske forskningsstudier for å få mer belysning av de termodynamiske detaljene i denatureringsboblen.
Denaturering på grunn av kjemiske midler
Med polymerasekjedereaksjon (PCR) blant de mest populære kontekstene der DNA -denaturering er ønsket, er oppvarming den hyppigste metoden for denaturering. Bortsett fra denaturering ved varme, kan nukleinsyrer gjennomgå denatureringsprosessen gjennom forskjellige kjemiske midler som formamid , guanidin , natriumsalicylat , dimetylsulfoksid (DMSO), propylenglykol og urea . Disse kjemiske denatureringsmidlene senker smeltetemperaturen (T m ) ved å konkurrere om hydrogenbindingsgivere og akseptorer med eksisterende nitrogenholdige basepar. Noen midler kan til og med indusere denaturering ved romtemperatur. For eksempel har alkaliske midler (f.eks. NaOH) vist seg å denaturere DNA ved å endre pH og fjerne protoner som bidrar til hydrogenbinding. Disse denaturanter har blitt brukt til å lage Denaturing Gradient Gel Electrophoresis gel (DGGE), som fremmer denaturering av nukleinsyrer for å eliminere påvirkning av nukleinsyreform på deres elektroforetiske mobilitet.
Kjemisk denaturering som et alternativ
Den optiske aktiviteten (absorpsjon og spredning av lys) og hydrodynamiske egenskaper ( translasjonell diffusjon , sedimenteringskoeffisienter og rotasjonskorrelasjonstider ) for formamid- denaturerte nukleinsyrer er lik de for varmedenaturerte nukleinsyrer. Avhengig av ønsket effekt kan derfor kjemisk denaturerende DNA gi en mildere fremgangsmåte for denaturering av nukleinsyrer enn denaturering indusert av varme. Studier som sammenligner forskjellige denatureringsmetoder som oppvarming, perlemølle av forskjellige vulstørrelser, soningsonifisering og kjemisk denaturering viser at kjemisk denaturering kan gi raskere denaturering sammenlignet med de andre fysiske denatureringsmetodene som er beskrevet. Spesielt i tilfeller der rask renaturering er ønsket, kan kjemiske denatureringsmidler gi et ideelt alternativ til oppvarming. For eksempel er DNA -tråder denaturert med alkaliske midler som NaOH -renatur så snart fosfatbuffer tilsettes.
Denaturering på grunn av luft
Små, elektronegative molekyler som nitrogen og oksygen , som er de primære gassene i luft , påvirker betydningen av omgivende molekyler til å delta i hydrogenbinding . Disse molekylene konkurrerer med omgivende hydrogenbindingsakseptorer for hydrogenbindingsdonorer, og fungerer derfor som "hydrogenbindingsbrytere" og svekker samspillet mellom omgivende molekyler i miljøet. Antiparellelle tråder i DNA-dobbeltspiraler er ikke-kovalent bundet av hydrogenbinding mellom Watson- og Crick-basepar; nitrogen og oksygen opprettholder derfor potensialet til å svekke integriteten til DNA når det utsettes for luft. Som et resultat krever DNA -tråder utsatt for luft mindre kraft for å skille og eksemplifisere lavere smeltetemperaturer .
applikasjoner
Mange laboratorieteknikker er avhengige av evnen til nukleinsyrestrenger til å skilles. Ved å forstå egenskapene til nukleinsyredaturering ble følgende metoder opprettet:
Denaturanter
Protein denaturanter
Syrer
Sure proteindenaturanter inkluderer:
- Eddiksyre
- Trikloreddiksyre 12% i vann
- Sulfosalisylsyre
Baser
Baser fungerer på samme måte som syrer i denaturering. De inkluderer:
Løsemidler
De fleste organiske løsningsmidler denaturerer, inkludert:
Tverrbindende reagenser
Tverrbindingsmidler for proteiner inkluderer:
Kaotropiske midler
Kaotropiske midler inkluderer:
- Urea 6 - 8 mol/l
- Guanidiniumklorid 6 mol/l
- Litiumperklorat 4,5 mol/l
- Natriumdodecylsulfat
Reduktorer for disulfidbinding
Midler som bryter disulfidbindinger ved reduksjon inkluderer:
- 2-merkaptoetanol
- Ditiotreitol
- TCEP (tris (2-karboksietyl) fosfin)
Kjemisk reaktive midler
Midler som hydrogenperoksid, elementært klor, hypoklorsyre (klorvann), brom, bromvann, jod, salpetersyre og oksiderende syrer og ozon reagerer med følsomme enheter som sulfid/tiol, aktiverte aromatiske ringer (fenylalanin) skader i virkeligheten protein og gjør det ubrukelig.
Annen
- Mekanisk omrøring
- Pikrinsyre
- Stråling
- Temperatur
Nukleinsyre denaturanter
Kjemisk
Sure nukleinsyredenaturanter inkluderer:
- Eddiksyre
- HCl
- Salpetersyre
Grunnleggende nukleinsyredenaturanter inkluderer:
- NaOH
Andre nukleinsyredenaturanter inkluderer:
Fysisk
- Termisk denaturering
- Perler mill
- Probe sonikering
- Stråling