Förster resonans energioverføring - Förster resonance energy transfer

Jablonski -diagram over FRET med typiske tidsplaner angitt. Vær oppmerksom på at den svarte stiplede linjen indikerer et virtuelt foton .

Förster eller fluorescensresonansenergioverføring ( FRET ), resonansenergioverføring ( RET ) eller elektronisk energioverføring ( EET ) er en mekanisme som beskriver energioverføring mellom to lysfølsomme molekyler ( kromoforer ). En donorkromofor, opprinnelig i sin elektroniske eksiterte tilstand, kan overføre energi til en akseptorkromofor gjennom ikke -strålende dipol -dipolkobling . Effektiviteten til denne energioverføringen er omvendt proporsjonal med den sjette effekten av avstanden mellom donor og akseptor, noe som gjør FRET ekstremt følsom for små endringer i avstand.

Målinger av FRET -effektivitet kan brukes til å avgjøre om to fluoroforer er innenfor en viss avstand fra hverandre. Slike målinger brukes som et forskningsverktøy innen områder som biologi og kjemi.

FRET er analogt med nærfeltskommunikasjon , ved at interaksjonsradiusen er mye mindre enn bølgelengden til lyset som sendes ut. I nærfeltområdet sender den eksiterte kromoforen ut et virtuelt foton som umiddelbart absorberes av en mottakende kromofor. Disse virtuelle fotonene er ikke påviselige, siden deres eksistens krenker bevaring av energi og momentum, og derfor er FRET kjent som en strålingsfri mekanisme. Kvantelektrodynamiske beregninger har blitt brukt for å bestemme at strålingsfri (FRET) og strålingsenergioverføring er de korte og lange avstandene asymptoter av en enkelt enhetlig mekanisme.

Terminologi

Tegneserie diagram over konseptet med Förster resonance energy transfer (FRET).

Förster resonansenergioverføring er oppkalt etter den tyske forskeren Theodor Förster . Når begge kromoforene er fluorescerende, brukes i stedet ofte begrepet "fluorescensresonansenergioverføring", selv om energien faktisk ikke overføres ved fluorescens . For å unngå en feilaktig tolkning av fenomenet som alltid er en ikke -strålende energioverføring (selv når det forekommer mellom to fluorescerende kromoforer), er navnet "Förster resonansenergioverføring" foretrukket fremfor "fluorescensresonansenergioverføring"; sistnevnte nyter imidlertid vanlig bruk i vitenskapelig litteratur. FRET er ikke begrenset til fluorescens og forekommer også i forbindelse med fosforescens.

Teoretisk grunnlag

FRET-effektiviteten ( ) er kvanteutbyttet av energioverføringsovergangen, det vil si sannsynligheten for at energioverføringshendelse oppstår per donator-eksitasjonshendelse: ${\ displaystyle E}$

${\ displaystyle E = {\ frac {k _ {\ text {ET}}} {k_ {f}+k _ {\ text {ET}}+\ sum {k_ {i}}}},}$

hvor er energioverføringshastigheten, donorens strålingsforfallshastighet og hastighetene for andre de-eksitasjonsveier unntatt energioverføringer til andre aksepterere. ${\ displaystyle k _ {\ text {ET}}}$${\ displaystyle k_ {f}}$${\ displaystyle k_ {i}}$

Den FRET effektivitet avhenger av mange fysiske parametere som kan grupperes som: 1) avstanden mellom donor og akseptor (typisk i størrelsesorden 1-10 nm), 2) den spektrale overlapping av donor emisjonsspekteret og akseptoren absorpsjon spektrum , og 3) den relative orienteringen av donoremisjonsdipolmomentet og akseptorabsorpsjonens dipolmoment.

${\ displaystyle E}$avhenger av donor-til-akseptor separasjonsavstand med en invers sjetteffektlov på grunn av dipol-dipol-koblingsmekanismen: ${\ displaystyle r}$

${\ displaystyle E = {\ frac {1} {1+ (r/R_ {0})^{6}}}}$

med å være Förster -avstanden til dette donor- og akseptparet, det vil si avstanden hvor energieffektivitetseffekten er 50%. Forster avstand er avhengig av overlappingen integralet av donor emisjonsspekteret med akseptoren absorpsjonsspektrum og deres innbyrdes molekylær orientering som uttrykkes ved følgende ligning: ${\ displaystyle R_ {0}}$

${\ displaystyle {R_ {0}} ^{6} = {\ frac {2.07} {128 \, \ pi ^{5} \, N_ {A}}} \, {\ frac {\ kappa ^{2} \, Q_ {D}} {n^{4}}} {\ int F _ {\ rm {D}} (\ lambda) \, \ epsilon _ {\ rm {A}} (\ lambda) \, \ lambda ^{4} \, d \ lambda}}$

der er fluorescens kvanteutbytte av donor i fravær av akseptor, er den dipol orientering faktor, er brytningsindeksen for mediet, er Avogadros konstant , og er den spektrale overlapping integral beregnet ${\ displaystyle Q _ {\ tekst {D}}}$${\ displaystyle \ kappa ^{2}}$${\ displaystyle n}$${\ displaystyle N _ {\ tekst {A}}}$${\ displaystyle J}$

${\ displaystyle J = {\ frac {\ int f _ {\ text {D}} (\ lambda) \ epsilon _ {\ text {A}} (\ lambda) \ lambda ^{4} \, d \ lambda} { \ int f _ {\ text {D}} (\ lambda) \, d \ lambda}} = \ int {\ overline {f _ {\ text {D}}}} (\ lambda) \ epsilon _ {\ text {A }} (\ lambda) \ lambda ^{4} \, d \ lambda,}$

hvor er donorutslippsspekteret, er donorutslippsspekteret normalisert til et område på 1, og er akseptorens molære ekstinksjonskoeffisient , vanligvis hentet fra et absorpsjonsspekter. Orienteringsfaktoren κ er gitt av ${\ displaystyle f _ {\ tekst {D}}}$${\ displaystyle {\ overline {f _ {\ text {D}}}}}$${\ displaystyle \ epsilon _ {\ text {A}}}$

${\ displaystyle \ kappa = {\ hat {\ mu}} _ {\ text {A}} \ cdot {\ hat {\ mu}} _ {\ text {D}}-3 ({\ hat {\ mu} } _ {\ text {D}} \ cdot {\ hat {R}}) ({\ hat {\ mu}} _ {\ text {A}} \ cdot {\ hat {R}}),}$

hvor betegner det normaliserte overgangsdipolmomentet for den respektive fluoroforen, og angir den normaliserte inter-fluorofor-forskyvningen. = 2/3 antas ofte. Denne verdien oppnås når begge fargestoffene roterer fritt og kan anses å være isotropisk orientert i løpet av levetiden for eksitert tilstand. Hvis enten fargestoffet er fikset eller ikke er fritt til å rotere, vil = 2/3 ikke være en gyldig antagelse. I de fleste tilfeller, men til og med beskjedne reorientering av fargestoffer som fører til nok orienterings midling at = 2/3 ikke resulterer i en stor feil i den beregnede energioverføringsavstanden på grunn av den sjette strøm avhengighet av på . Selv når den er ganske forskjellig fra 2/3, kan feilen være assosiert med et skifte i , og dermed er bestemmelser av endringer i relativ avstand for et bestemt system fortsatt gyldige. Fluorescerende proteiner omorienteres ikke på en tidsskala som er raskere enn fluorescenslevetiden. I dette tilfellet 0 ≤ ≤ 4. ${\ displaystyle {\ hat {\ mu}} _ {i}}$${\ displaystyle {\ hat {R}}}$${\ displaystyle \ kappa ^{2}}$${\ displaystyle \ kappa ^{2}}$${\ displaystyle \ kappa ^{2}}$${\ displaystyle R_ {0}}$${\ displaystyle \ kappa ^{2}}$${\ displaystyle \ kappa ^{2}}$${\ displaystyle R_ {0}}$${\ displaystyle \ kappa ^{2}}$

For tidsavhengige analyser av FRET kan hastigheten for energioverføring ( ) brukes i stedet direkte: ${\ displaystyle k _ {\ text {ET}}}$

${\ displaystyle k _ {\ text {ET}} = ({\ frac {R_ {0}} {r}})^{6} \, {\ frac {1} {\ tau _ {D}}}}$

hvor er donorens fluorescenslevetid i fravær av akseptoren. ${\ displaystyle \ tau _ {D}}$

FRET -effektiviteten er knyttet til kvanteutbyttet og fluorescenslevetiden til donormolekylet som følger:

${\ displaystyle E = 1- \ tau '_ {\ text {D}}/\ tau _ {\ text {D}},}$

hvor og er donorens fluorescenslevetid i henholdsvis tilstedeværelse og fravær av en akseptor, eller som ${\ displaystyle \ tau _ {\ text {D}} '}$${\ displaystyle \ tau _ {\ text {D}}}$

${\ displaystyle E = 1-F _ {\ text {D}} '/F _ {\ text {D}},}$

hvor og er donorens fluorescensintensiteter med henholdsvis og uten en acceptor. ${\ displaystyle F _ {\ text {D}} '}$${\ displaystyle F _ {\ text {D}}}$

Eksperimentell bekreftelse av Förster resonans energioverføringsteori

Den omvendte sjetteffektavstandsavhengigheten til Förster resonansenergioverføring ble eksperimentelt bekreftet av Wilchek , Edelhoch og Brand ved bruk av tryptofylpeptider. Stryer , Haugland og Yguerabide demonstrerte også eksperimentelt den teoretiske avhengigheten av Förster resonansenergioverføring av overlappingsintegralet ved å bruke et smeltet indolosteroid som en donor og et keton som en akseptor. Det ble imidlertid observert mange motsetninger av spesielle eksperimenter med teorien. Årsaken er at teorien har omtrentlig karakter og gir overvurderte avstander på 50–100 ångströms.

Metoder for å måle FRET -effektivitet

I fluorescens mikroskopi , fluorescens konfokal laser-skanning mikroskopi , så vel som i molekylær biologi , er FRET et nyttig verktøy for å kvantifisere molekylær dynamikk i biofysikk og biokjemi , såsom protein -protein vekselvirkninger, protein- DNA- interaksjoner, og protein konformasjonsendringer. For å overvåke den komplekse dannelsen mellom to molekyler, er den ene merket med en donor og den andre med en akseptor. FRET -effektiviteten måles og brukes til å identifisere interaksjoner mellom de merkede kompleksene. Det er flere måter å måle FRET -effektiviteten ved å overvåke endringer i fluorescensen som donoren eller akseptoren sender ut.

Sensitiv utslipp

En metode for å måle FRET -effektivitet er å måle variasjonen i akseptoremisjonsintensitet. Når donor og akseptor er i nærheten (1–10 nm) på grunn av samspillet mellom de to molekylene, vil akseptoremisjonen øke på grunn av den intermolekylære FRET fra donor til acceptor. For overvåking av proteinkonformasjonsendringer, er målproteinet merket med en donor og en akseptor på to steder. Når en vridning eller bøyning av proteinet fører til endring i avstand eller relativ orientering til donor og akseptor, observeres FRET -endring. Hvis en molekylær interaksjon eller en proteinkonformasjonsendring er avhengig av ligandbinding , er denne FRET -teknikken anvendelig på fluorescerende indikatorer for liganddeteksjon.

Fotobleking FRET

FRET -effektivitet kan også utledes av fotoblegingshastigheten til giveren i nærvær og fravær av en akseptor. Denne metoden kan utføres på de fleste fluorescensmikroskoper; man bare skinner eksitasjonslyset (med en frekvens som vil opphisse donoren, men ikke akseptoren vesentlig) på prøver med og uten akseptor fluoroforen og overvåker donorfluorescensen (vanligvis atskilt fra acceptor fluorescens ved hjelp av et båndpassfilter ) over tid. Tidsskalaen er for fotobleking, som er sekunder til minutter, med fluorescens i hver kurve gitt av

${\ displaystyle {\ text {bakgrunn}}+{\ tekst {konstant}} \ cdot e^{-{\ tekst {tid}}/\ tau _ {\ tekst {pb}}},}$

hvor er forfallstiden for fotoblekning og avhenger av om akseptoren er tilstede eller ikke. Siden fotobleking består i permanent inaktivering av eksiterte fluoroforer, forhindrer resonansenergioverføring fra en opphisset donor til en akseptorfluorofor fotobleking av den donorfluoroforen, og dermed fører høy FRET -effektivitet til en lengre tid for konstant fotobleking: ${\ displaystyle \ tau _ {\ text {pb}}}$

${\ displaystyle E = 1- \ tau _ {\ text {pb}}/\ tau _ {\ text {pb}} ',}$

hvor og er fotoblekings forfallstidskonstantene til giveren i henholdsvis nærvær og i fravær av akseptoren. (Legg merke til at brøkdelen er gjensidig med den som ble brukt for livstidsmålinger). ${\ displaystyle \ tau _ {\ text {pb}} '}$${\ displaystyle \ tau _ {\ text {pb}}}$

Denne teknikken ble introdusert av Jovin i 1989. Bruken av en hel kurve av punkter for å trekke ut tidskonstantene kan gi den nøyaktighetsfordeler i forhold til de andre metodene. Det faktum at tidsmålinger er over sekunder i stedet for nanosekunder, gjør det lettere enn fluorescens levetid målinger, og fordi fotoblekning forfallshastigheter generelt ikke er avhengig av donorkonsentrasjon (med mindre akseptormetning er et problem), er nøye kontroll av konsentrasjoner som trengs for intensitet målinger er ikke nødvendig. Det er imidlertid viktig å holde belysningen den samme for målingene med og uten aksept, ettersom fotobleking øker markant med mer intens innfallende lys.

Levetid målinger

FRET effektivitet kan også bestemmes ut fra endringen i fluorescens levetiden av donor. Giverens levetid vil reduseres i nærvær av akseptoren. Levetid målinger av FRET-donor brukes i fluorescens levetid imaging mikroskopi (FLIM).

Fluoroforer brukt til FRET

Hvis linkeren er intakt, forårsaker eksitasjon ved absorbansbølgelengden til CFP (414nm) utslipp av YFP (525nm) på grunn av FRET. Hvis linkeren spaltes av en protease, oppheves FRET og utslippet er ved CFP -bølgelengden (475 nm).

CFP-YFP par

Et vanlig par fluoroforer for biologisk bruk er et cyan -fluorescerende protein (CFP) - gult fluorescerende protein (YFP) -par. Begge er fargevarianter av grønt fluorescerende protein (GFP). Merking med organiske fluorescerende fargestoffer krever rensing, kjemisk modifikasjon og intracellulær injeksjon av et vertsprotein. GFP -varianter kan festes til et vertsprotein ved genteknologi som kan være mer praktisk. I tillegg kan en fusjon av CFP og YFP ("tandem-dimer") koblet med en proteasespaltningssekvens brukes som en spaltningsanalyse.

BRET

En begrensning av FRET utført med fluorofordonorer er kravet til ekstern belysning for å starte fluorescensoverføringen, noe som kan føre til bakgrunnsstøy i resultatene fra direkte eksitasjon av akseptoren eller til fotobleking . For å unngå denne ulempen har bioluminescensresonansenergioverføring (eller BRET ) blitt utviklet. Denne teknikken bruker en bioluminescerende luciferase (vanligvis luciferase fra Renilla reniformis ) i stedet for CFP for å produsere en første fotonemisjon som er kompatibel med YFP.

BRET er også implementert ved bruk av et annet luciferaseenzym, konstruert fra dyphavsreken Oplophorus gracilirostris . Denne luciferasen er mindre (19 kD) og lysere enn den mer brukte luciferasen fra Renilla reniformis ., Og har fått navnet NanoLuc eller NanoKAZ. Promega har utviklet et patentert substrat for NanoLuc kalt furimazin, selv om andre verdisaker coelenterazinesubstrater for NanoLuc også har blitt publisert En split-protein-versjon av NanoLuc er utviklet av Promega, som også har blitt brukt som BRET-donor i eksperimenter som måler protein-protein-interaksjoner

Homo-FRET

Generelt refererer "FRET" til situasjoner der donor og akseptorproteiner (eller "fluoroforer") er av to forskjellige typer. I mange biologiske situasjoner kan det imidlertid hende at forskere må undersøke samspillet mellom to eller flere proteiner av samme type - eller faktisk det samme proteinet med seg selv, for eksempel hvis proteinet bretter seg eller utgjør en del av en polymerkjede av proteiner eller for andre spørsmål om kvantifisering i biologiske celler.

Åpenbart vil spektrale forskjeller ikke være verktøyet som brukes til å oppdage og måle FRET, ettersom både akseptor og donorprotein avgir lys med de samme bølgelengdene. Likevel kan forskere oppdage forskjeller i polarisasjonen mellom lyset som begeistrer fluoroforene og lyset som sendes ut, i en teknikk kalt FRET anisotropy imaging; nivået av kvantifisert anisotropi (forskjell i polarisering mellom eksitasjons- og utslippsstråler) blir deretter en veiledning for hvor mange FRET -hendelser som har skjedd.

Andre

Ulike forbindelser ved siden av fluorescerende proteiner.

applikasjoner

Anvendelsene av fluorescensresonansenergioverføring (FRET) har utvidet seg enormt de siste 25 årene, og teknikken har blitt en stift i mange biologiske og biofysiske felt. FRET kan brukes som en spektroskopisk linjal for å måle avstand og oppdage molekylære interaksjoner i en rekke systemer og har anvendelser innen biologi og biokjemi.

Proteiner

FRET brukes ofte til å oppdage og spore interaksjoner mellom proteiner. I tillegg kan FRET brukes til å måle avstander mellom domener i et enkelt protein ved å merke forskjellige regioner av proteinet med fluoroforer og måle utslipp for å bestemme avstand. Dette gir informasjon om proteinkonformasjon , inkludert sekundære strukturer og proteinfolding . Dette strekker seg til å spore funksjonelle endringer i proteinstruktur, for eksempel konformasjonsendringer forbundet med myosinaktivitet . Påført in vivo har FRET blitt brukt til å oppdage lokalisering og interaksjoner mellom mobilstrukturer inkludert integriner og membranproteiner .

Membraner

FRET kan brukes til å observere membranfluiditet , bevegelse og spredning av membranproteiner, membranlipid-protein og protein-protein-interaksjoner og vellykket blanding av forskjellige membraner. FRET brukes også til å studere dannelse og egenskaper av membrandomener og lipidflåter i cellemembraner og for å bestemme overflatetetthet i membraner.

Kjemosensorisk

FRET-basert sonde som aktiveres ved interaksjon med Cd2+

FRET-baserte sonder kan detektere tilstedeværelsen av forskjellige molekyler: sondens struktur påvirkes av binding av små molekyler eller aktivitet, noe som kan slå FRET-systemet på eller av. Dette brukes ofte til å oppdage anioner, kationer, små uladede molekyler og noen større biomakromolekyler også. På samme måte har FRET -systemer blitt designet for å oppdage endringer i mobilmiljøet på grunn av faktorer som pH , hypoksi eller mitokondrielt membranpotensial .

Signalveier

En annen bruk for FRET er i studiet av metabolske eller signalveier . For eksempel har FRET og BRET blitt brukt i forskjellige eksperimenter for å karakterisere G-protein-koblet reseptoraktivering og påfølgende signalmekanismer. Andre eksempler inkluderer bruk av FRET for å analysere så forskjellige prosesser som bakteriell kjemotaksi og caspaseaktivitet ved apoptose .

Andre applikasjoner

I tillegg til tidligere nevnte bruksområder, er FRET og BRET også effektive i studiet av biokjemisk reaksjonskinetikk. FRET brukes stadig mer for å overvåke pH -avhengig montering og demontering og er verdifull i analysen av nukleinsyrer . Denne teknikken kan brukes til å bestemme faktorer som påvirker ulike typer nanopartikkeldannelse , samt mekanismer og effekter av nanomedisiner .

Andre metoder

En annen, men beslektet, mekanisme er Dexter elektronoverføring .

En alternativ metode for å påvise nærhet mellom protein og protein er bimolekylær fluorescenskomplementering (BiFC), hvor to deler av et fluorescerende protein hver er smeltet til andre proteiner. Når disse to delene møtes, danner de en fluorofor på en tidsskala på minutter eller timer.

Se også

• Dexter elektronoverføring
• Förster kobling
• Overføring av overflatenergi
• Tidsoppløst fluorescens energioverføring

Referanser

Eksterne linker

• FRET -effekt i en tynn film på YouTube
• FRET Imaging (Opplæring av Becker & Hickl, nettsted)