Hoechst flekk - Hoechst stain
Hoechst flekker er en del av en familie av blå fluorescerende fargestoffer som brukes til å flekker DNA . Disse Bis-benzimidene ble opprinnelig utviklet av Hoechst AG , som nummererte alle deres forbindelser slik at fargestoffet Hoechst 33342 er den 33.342. forbindelse laget av selskapet. Det er tre beslektede Hoechst-flekker: Hoechst 33258, Hoechst 33342 og Hoechst 34580. Fargestoffene Hoechst 33258 og Hoechst 33342 er de som oftest brukes, og de har lignende eksitasjon - emisjonsspektre .
Molekylære egenskaper
Begge fargestoffene blir begeistret av ultrafiolett lys ved rundt 350 nm , og begge avgir blå-cyan fluorescerende lys rundt et emisjonsspektrum maksimum ved 461 nm. Ubundet fargestoff har sitt maksimale fluorescensutslipp i området 510–540 nm. Hoechst-flekker kan opphisses med en xenon- eller kvikksølvbue-lampe eller med en ultrafiolett laser . Det er et betydelig Stokes-skifte mellom eksitasjon og utslippsspektre som gjør Hoechst-fargestoffer nyttige i eksperimenter der flere fluoroforer brukes. Fluorescensintensiteten til Hoechst-fargestoffer øker også med pH i løsningsmidlet .
Hoechst fargestoffer er oppløselige i vann og i organiske løsningsmidler som dimetylformamid eller dimetylsulfoksid . Konsentrasjoner kan oppnås på opptil 10 mg / ml. Vandige oppløsninger er stabile ved 2–6 ° C i minst seks måneder når de er beskyttet mot lys. For langvarig lagring blir løsningene i stedet frosset ved -20 ° C eller lavere.
Fargestoffene binder seg til mindre spor av dobbeltstrenget DNA med en preferanse for sekvenser rike på adenin og tymin . Selv om fargestoffene kan binde seg til alle nukleinsyrer, forbedrer AT-rike dobbeltstrengede DNA-tråder fluorescensen betraktelig. Hoechst fargestoffer er celle- gjennomtrengelige og kan binde seg til DNA i levende eller fikserte celler . Dermed blir disse flekkene ofte kalt supravital , noe som betyr at levende celler overlever en behandling med disse forbindelsene. Celler som uttrykker bestemte ATP-bindende kassett transportørproteiner kan også aktivt transportere disse flekkene ut av deres cytoplasma .
applikasjoner
En konsentrasjon på 0,1–12 μg / ml brukes ofte til å flekker DNA i bakterier eller eukaryote celler. Cellene farges i 1-30 minutter ved romtemperatur eller 37 ° C og vaskes deretter for å fjerne ubundet fargestoff. En grønn fluorescens av ubundet Hoechst-fargestoff kan observeres på prøver som er farget med for mye fargestoff eller som blir vasket delvis. Hoechst fargestoffer brukes ofte som erstatninger for en annen nukleinsyre flekk kalt DAPI .
Viktige forskjeller mellom Hoechst-fargestoffer og DAPI er:
- Hoechst fargestoffer er mindre giftige enn DAPI, noe som sikrer en høyere levedyktighet av fargede celler
- Den ekstra etylgruppen i Hoechst-fargestoffene gjør dem mer cellegjennomtrengelige.
- Det er kjerner farging fargestoffer som tillater levedyktighet av celler etter farging.
Hoechst 33342 og 33258 slukkes av bromodeoksyuridin (BrdU), som ofte brukes til å oppdage delende celler. Hoechst 33342 har en 10 ganger større cellepermeabilitet enn H 33258. Celler kan integrere BrdU i nysyntetisert DNA som en erstatning for tymidin . Når BrdU er integrert i DNA, antas det at brom deformerer mindre spor slik at Hoechst-fargestoffer ikke kan nå sitt optimale bindingssted. Binding av Hoechst-fargestoffer er enda sterkere for BrdU-substituert DNA; Imidlertid følger ingen fluorescens. Hoechst fargestoffer kan brukes med BrdU for å overvåke cellesyklusprogresjon .
Hoechst-fargestoffer brukes ofte til å flekker genomisk DNA i følgende applikasjoner:
- Fluorescensmikroskopi og immunhistokjemi , ofte med andre fluoroforer
- Flowcytometri for å telle eller sortere ut celler. Et eksempel er bruken av Hoechst-fargestoffer for å analysere hvor mange celler i en populasjon som er i hvilken fase av cellesyklusen
- Påvisning av DNA i nærvær av RNA i agarosegeler
- Automatisert DNA-bestemmelse
- Kromosomsortering
Hoechst efflux brukes også til å studere hematopoietiske og embryonale stamceller. Ettersom disse cellene er i stand til effektivt å strømme ut fargestoffet, kan de påvises via strømningscytometri i det som kalles sidepopulasjonen . Dette gjøres ved å føre fluorescensen som sendes fra den eksiterte hoechst gjennom både røde og blå filtre, og plotte hoechst rød og blå mot hverandre.
Toksisitet og sikkerhet
Fordi Hoechst-flekker binder seg til DNA, forstyrrer de DNA-replikering under celledeling . Derfor er de potensielt mutagene og kreftfremkallende , så det bør utvises forsiktighet ved håndtering og avhending. Hoechst-flekken brukes til å sortere sæd hos husdyr og mennesker. Sikkerheten har blitt diskutert.