lac operon - lac operon

Den laktose -operonet ( lac -operonet) er et operon som kreves for transport og metabolisme av laktose i E. coli og mange andre enteriske bakterier . Selv om glukose er den foretrukne karbonkilden for de fleste bakterier, åpner lac operon for effektiv fordøyelse av laktose når glukose ikke er tilgjengelig gjennom aktiviteten til beta-galaktosidase . Genregulering av lac operon var den første genetiske reguleringsmekanismen som ble forstått tydelig, så det har blitt et fremste eksempel på prokaryot genregulering . Det diskuteres ofte i innledende molekylær og cellulær biologi klasser av denne grunn. Dette laktosemetabolismesystemet ble brukt av François Jacob og Jacques Monod for å bestemme hvordan en biologisk celle vet hvilket enzym som skal syntetiseres. Arbeidet med lac operon ga dem Nobelprisen i fysiologi i 1965.

Bakterielle operoner er polykistroniske transkripsjoner som er i stand til å produsere flere proteiner fra ett mRNA -transkript. I dette tilfellet, når laktose er nødvendig som en sukkerkilde for bakterien, de tre genene i lac -operonet kan uttrykkes og deres påfølgende proteiner oversatt: lacZ , lacY , og laca . Genproduktet til lacZ er β-galaktosidase som spalter laktose, et disakkarid , til glukose og galaktose . lacY koder for Beta-galaktosidpermease , et membranprotein som blir innebygd i den cytoplasmatiske membranen for å muliggjøre cellulær transport av laktose til cellen. Til slutt koder lacA for Galactoside acetyltransferase .

Oppsett av lac operon.

Den lac -operonet. Topp: undertrykt, bunn: aktiv.
1 : RNA -polymerase , 2 : Repressor, 3 : Promoter, 4 : Operator, 5 : Laktose, 6 : lacZ , 7 : lacY , 8 : lacA .

Det ville være sløsing å produsere enzymer når ingen laktose er tilgjengelig eller hvis en foretrukket energikilde som glukose var tilgjengelig. Den lac -operonet benytter en to-delt kontrollmekanisme for å sikre at celle expends energi produserende enzymer som kodes for av lac -operonet bare når det er nødvendig. I fravær av laktose stopper lac -repressoren , lacI, produksjonen av enzymene som kodes av lac -operonet. Lac-repressoren uttrykkes alltid, med mindre en co-induktor binder seg til den. Med andre ord, det transkriberes bare i nærvær av småindikatorer. I nærvær av glukose forblir katabolittaktivatorproteinet (CAP), som er nødvendig for produksjon av enzymene, inaktivt, og EIIA Glc slår av laktosepermease for å forhindre transport av laktose inn i cellen. Denne dobbelte kontrollmekanismen forårsaker sekvensiell bruk av glukose og laktose i to forskjellige vekstfaser, kjent som diauxie .

Struktur

Laktosestruktur og produktene fra spaltningen.


Bare lacZ og lacY ser ut til å være nødvendig for laktosekatabolsk vei .

Genetisk nomenklatur

Forkortelser på tre bokstaver brukes til å beskrive fenotyper i bakterier inkludert E. coli .

Eksempler inkluderer:

  • Lac (evnen til å bruke laktose),
  • Hans (evnen til å syntetisere aminosyren histidin)
  • Mot (svømmemotilitet)
  • Sm R (resistens mot antibiotika streptomycin )

Når det gjelder Lac, er villtypeceller Lac + og kan bruke laktose som karbon og energikilde, mens Lac - mutantderivater ikke kan bruke laktose. De samme tre bokstavene brukes vanligvis (små bokstaver, kursiv) for å merke genene som er involvert i en bestemt fenotype, der hvert forskjellige gen i tillegg skilles med en ekstra bokstav. De lac- gener som koder for enzymer som er lacZ , lacY , og laca . Det fjerde lac -genet er lacI , som koder for laktoserepressoren - "I" står for induserbarhet .



Man kan skille mellom strukturelle gener som koder for enzymer, og regulatoriske gener som koder for proteiner som påvirker genuttrykk. Gjeldende bruk utvider den fenotypiske nomenklaturen til å gjelde proteiner: LacZ er dermed proteinproduktet av lacZ- genet, β-galaktosidase. Ulike korte sekvenser som ikke er gener påvirker også genuttrykk, inkludert lac -promotoren, lac p , og lac -operatøren, lac o . Selv om det ikke er strengt standard bruk, blir mutasjoner som påvirker lac o referert til som lac o c , av historiske årsaker.

Inducer

Regulering

Spesifikk kontroll av lac -genene avhenger av tilgjengeligheten av substratet laktose til bakterien. Proteinene produseres ikke av bakterien når laktose ikke er tilgjengelig som karbonkilde. De lac- genene er organisert i et operon ; det vil si at de er orientert i samme retning umiddelbart ved siden av kromosomet og blir transkribert til et enkelt polykistronisk mRNA-molekyl. Transkripsjon av alle gener starter med bindingen av enzymet RNA-polymerase (RNAP), et DNA-bindende protein , som binder seg til et spesifikt DNA-bindingssted, promotoren , umiddelbart oppstrøms for genene. Binding av RNA -polymerase til promotoren blir hjulpet av cAMP -bundet katabolittaktivatorprotein (CAP, også kjent som cAMP -reseptorproteinet). Imidlertid produserer lacI -genet (regulatorisk gen for lac operon) et protein som blokkerer RNAP fra å binde seg til operonens operon. Dette proteinet kan bare fjernes når allolaktose binder seg til det, og inaktiverer det. Proteinet som dannes av lacI -genet er kjent som lac -repressoren. Reguleringstypen som lac operon gjennomgår blir referert til som negativ induserbar, noe som betyr at genet blir slått av av den regulatoriske faktoren ( lac repressor) med mindre noe molekyl (laktose) tilsettes. På grunn av tilstedeværelsen av lac -repressorproteinet, må genetiske ingeniører som erstatter lacZ -genet med et annet gen dyrke de eksperimentelle bakteriene på agar med laktose tilgjengelig på det. Hvis de ikke gjør det, vil genet de prøver å uttrykke ikke bli uttrykt ettersom repressorproteinet fremdeles blokkerer RNAP fra å binde seg til promotoren og transkribere genet. Når repressoren er fjernet, fortsetter RNAP å transkribere alle tre genene ( lacZYA ) til mRNA. Hver av de tre genene på mRNA-strengen har sin egen Shine-Dalgarno-sekvens , så genene blir uavhengig oversatt. DNA -sekvensen til E. coli lac operon , lacZYA mRNA og lacI -genene er tilgjengelig fra GenBank (visning) .

Den første kontrollmekanismen er den regulatoriske responsen på laktose, som bruker et intracellulært regulatorisk protein kalt laktoserepressoren for å hindre produksjon av β-galaktosidase i fravær av laktose. Den lacl -genet som koder for repressoren ligger i nærheten av lac -operonet og er alltid uttrykt ( konstitutiv ). Hvis laktose mangler fra vekstmediet, binder repressoren veldig tett til en kort DNA -sekvens like nedstrøms promotoren nær begynnelsen av lacZ, kalt lac -operatøren . Repressorbindingen til operatøren forstyrrer bindingen av RNAP til promotoren, og derfor blir mRNA som koder for LacZ og LacY bare laget på svært lave nivåer. Når celler vokser i nærvær av laktose , binder imidlertid en laktosemetabolitt kalt allolaktose, laget av laktose av produktet av lacZ -genet, seg til repressoren og forårsaker et allosterisk skifte. Således endret, er repressoren ikke i stand til å binde seg til operatøren, slik at RNAP kan transkribere lac -genene og dermed føre til høyere nivåer av de kodede proteinene.

Den andre kontrollmekanismen er et svar på glukose, som bruker katabolittaktivatorprotein (CAP) homodimeren for å øke produksjonen av β-galaktosidase sterkt i fravær av glukose. Syklisk adenosinmonofosfat (cAMP) er et signalmolekyl hvis prevalens er omvendt proporsjonal med glukose. Den binder seg til CAP, som igjen tillater CAP å binde seg til CAP -bindingsstedet (en 16 bp DNA -sekvens oppstrøms for promotoren til venstre i diagrammet nedenfor, omtrent 60 bp oppstrøms for transkripsjonsstartstedet), som hjelper RNAP ved binding til DNA. I fravær av glukose er cAMP-konsentrasjonen høy og binding av CAP-cAMP til DNA øker produksjonen av β-galaktosidase betydelig, slik at cellen kan hydrolysere laktose og frigjøre galaktose og glukose.

Nylig ble det vist at induserekskludering blokkerer ekspresjon av lac operon når glukose er tilstede. Glukose transporteres inn i cellen av det PEP-avhengige fosfotransferasesystemet . Fosfatgruppen til fosfoenolpyruvat overføres via en fosforyleringskaskade som består av det generelle PTS (fosfotransferasesystemet) proteinene HPr og EIA og de glukosespesifikke PTS-proteinene EIIA Glc og EIIB Glc , det cytoplasmatiske domenet til EII glukosetransportøren. Transport av glukose ledsages av fosforylering av EIIB Glc , som tapper fosfatgruppen fra de andre PTS -proteinene, inkludert EIIA Glc . Den ufosforylerte formen av EIIA Glc binder seg til lac -permeasen og forhindrer den i å bringe laktose inn i cellen. Derfor, hvis både glukose og laktose er tilstede, blokkerer transporten av glukose transporten av induseren til lac operon.

Repressorstruktur

Tetrameric LacI binder to operatørsekvenser og induserer DNA -looping. To dimeriske LacI -funksjonelle underenheter (rød+blå og grønn+oransje) binder hver en DNA -operatørsekvens (merket). Disse to funksjonelle underenhetene er koblet til tetrameriseringsområdet (merket); således binder tetramerisk LacI to operatørsekvenser. Dette gjør at tetramerisk LacI kan indusere DNA -looping .

Den lac-repressor er en fire-del protein, en tetramer, med identiske subenheter. Hver underenhet inneholder et helix-turn-helix (HTH) motiv som er i stand til å binde seg til DNA. Operatørstedet der repressor binder er en DNA -sekvens med omvendt gjentatt symmetri. De to DNA-halvstedene til operatøren binder sammen til to av underenhetene til repressoren. Selv om de to andre underenhetene til repressoren ikke gjør noe i denne modellen, ble denne egenskapen ikke forstått på mange år.

Etter hvert ble det oppdaget at ytterligere to operatører er involvert i lakregulering . Den ene (O 3 ) ligger omtrent −90 bp oppstrøms for O 1 i enden av lacI -genet, og den andre (O 2 ) er omtrent +410 bp nedstrøms for O 1 i den tidlige delen av lacZ . Disse to nettstedene ble ikke funnet i det tidlige arbeidet fordi de har overflødige funksjoner og individuelle mutasjoner påvirker ikke undertrykkelse særlig. Enkeltmutasjoner til enten O 2 eller O 3 har bare 2 til 3 ganger effekter. Imidlertid demonstreres deres betydning av det faktum at en dobbel mutant defekt i både O 2 og O 3 er dramatisk av-undertrykt (ca. 70 ganger).

I den nåværende modellen er lac -repressor bundet samtidig til både hovedoperatøren O 1 og til enten O 2 eller O 3 . Det mellomliggende DNA løkker ut fra komplekset. Den overflødige naturen til de to mindre operatørene antyder at det ikke er et spesifikt loopet -kompleks som er viktig. En idé er at systemet fungerer gjennom tethering; hvis bundet repressor frigjøres fra O 1 for en stund, holder bindingen til en mindre operatør den i nærheten, slik at den kan spinne raskt tilbake. Dette vil øke affiniteten til repressor for O 1 .

Mekanisme for induksjon

1 : RNA Polymerase, 2 : Repressor, 3 : Promoter, 4 : Operator, 5 : Laktose, 6 : lacZ, 7 : lacY, 8 : lacA. Topp : Genet er i hovedsak slått av. Det er ingen allolaktose som hemmer lac -repressoren, så repressoren binder tett til operatøren, noe som hindrer RNA -polymerasen fra å binde seg til promotoren, noe som resulterer i ingen laczya -mRNA -transkripsjoner . Nederst : Genet er slått på. Allolaktose hemmer repressoren, slik at RNA -polymerasen kan binde seg til promotoren og uttrykke genene, noe som resulterer i produksjon av LacZYA. Til slutt vil enzymene fordøye all laktose, til det ikke er allolaktose som kan binde seg til repressoren. Repressoren vil deretter binde seg til operatøren og stoppe transkripsjonen av LacZYA -genene.

Repressoren er et allosterisk protein , det vil si at den kan anta enten en av to litt forskjellige former, som er i likevekt med hverandre. I den ene formen vil repressoren binde seg til operatør -DNA med høy spesifisitet, og i den andre formen har den mistet sin spesifisitet. I følge den klassiske modellen for induksjon påvirker binding av induktoren, enten allolaktose eller IPTG, til repressoren fordelingen av repressoren mellom de to figurene. Således stabiliseres repressoren med induktorbundet i den ikke-DNA-bindende konformasjonen. Imidlertid kan ikke denne enkle modellen være hele historien, fordi repressoren er bundet ganske stabilt til DNA, men den frigjøres raskt ved tilsetning av induktor. Derfor virker det klart at en induktor også kan binde seg til repressoren når repressoren allerede er bundet til DNA. Det er fremdeles ikke helt kjent hva den eksakte bindingsmekanismen er.

Rollen til uspesifikk binding

Uspesifikk binding av repressoren til DNA spiller en avgjørende rolle i undertrykkelse og induksjon av Lac-operon. Det spesifikke bindingsstedet for Lac-repressor-proteinet er operatøren. Den uspesifikke interaksjonen medieres hovedsakelig av ladning-ladningsinteraksjoner mens binding til operatøren forsterkes av hydrofobe interaksjoner. I tillegg er det en overflod av uspesifikke DNA-sekvenser som repressoren kan binde seg til. I hovedsak anses enhver sekvens som ikke er operatøren, som uspesifikk. Studier har vist at uten tilstedeværelse av uspesifikk binding, kan induksjon (eller unrepression) av Lac-operon ikke forekomme selv med mettede nivåer av induktor. Det hadde blitt demonstrert at, uten uspesifikk binding, er det basale nivået av induksjon ti tusen ganger mindre enn det som observeres normalt. Dette er fordi det uspesifikke DNA fungerer som en slags "synke" for repressorproteinene, og distraherer dem fra operatøren. De uspesifikke sekvensene reduserer mengden tilgjengelig repressor i cellen. Dette reduserer igjen mengden induktor som kreves for å fjerne systemet.

Laktoseanaloger

IPTG
ONPG
X-gal
allolaktose

En rekke laktosederivater eller analoger har blitt beskrevet som er nyttige for arbeid med lac operon. Disse forbindelsene er hovedsakelig substituerte galaktosider, der glukosenheten til laktose erstattes av en annen kjemisk gruppe.

  • Isopropyl-β-D-tiogalaktopyranosid (IPTG) brukes ofte som en induktor av lac operon for fysiologisk arbeid. IPTG binder seg til repressor og inaktiverer den, men er ikke et substrat for β-galaktosidase. En fordel med IPTG for in vivo -studier er at siden den ikke kan metaboliseres av E. coli, forblir konsentrasjonen konstant og ekspresjonshastigheten til lac p/o -kontrollerte gener, er ikke en variabel i eksperimentet. IPTG inntak er avhengig av virkningen av laktosepermease i P. fluorescens , men ikke i E. coli .
  • Fenyl-β-D-galaktose (fenyl-Gal) er et substrat for β-galaktosidase, men inaktiverer ikke repressoren og er derfor ikke en induser. Siden villtypeceller produserer svært lite β-galaktosidase, kan de ikke vokse på fenyl-Gal som karbon- og energikilde. Mutanter som mangler repressor, kan vokse på fenyl-Gal. Således er minimalt medium som bare inneholder fenyl-Gal som kilde til karbon og energi, selektivt for repressormutanter og operatormutanter. Hvis 108 celler av en villtype-stamme utplates på agarplater som inneholder fenyl-Gal, er de sjeldne koloniene som vokser hovedsakelig spontane mutanter som påvirker repressoren. Den relative fordelingen av repressor- og operatormutanter påvirkes av målstørrelsen. Siden lacI -genet som koder for repressor er omtrent 50 ganger større enn operatøren, dominerer repressormutanter i utvalget.
  • Tiometylgalaktosid [TMG] er en annen laktose -analog. Disse hemmer lacI -repressoren. Ved lave induktorkonsentrasjoner kan både TMG og IPTG komme inn i cellen gjennom laktosepermeasen. Ved høye induktorkonsentrasjoner kan imidlertid begge analogene angi cellen uavhengig. TMG kan redusere vekstrater ved høye ekstracellulære konsentrasjoner.
  • Andre forbindelser fungerer som fargerike indikatorer på β-galaktosidaseaktivitet.
    • ONPG spaltes for å produsere den intenst gule forbindelsen, ortonitrofenol og galaktose, og brukes vanligvis som et substrat for analyse av β-galaktosidase in vitro .
    • Kolonier som produserer β-galaktosidase blir blå av X-gal (5-brom-4-klor-3-indolyl-β-D-galaktosid) som er et kunstig substrat for B-galaktosidase hvis spaltning resulterer i galaktose og 4-Cl , 3-Br indigo og gir dermed en dyp blå farge.
  • Allolaktose er en isomer av laktose og er induseren til lac operon. Laktose er galaktose-β (1 → 4) -glukose, mens allolaktose er galaktose-β (1 → 6) -glukose. Laktose omdannes til allolaktose av β-galaktosidase i en alternativ reaksjon på den hydrolytiske. Et fysiologisk eksperiment som demonstrerer LacZs rolle i produksjonen av den "sanne" induktoren i E. coli- celler, er observasjonen av at en nullmutant av lacZ fremdeles kan produsere LacY-permease når den vokser med IPTG, en ikke-hydrolyserbar analog av allolaktose, men ikke når den vokser med laktose. Forklaringen er at behandling av laktose til allolaktose (katalysert av β-galaktosidase) er nødvendig for å produsere induktoren inne i cellen.

Utvikling av den klassiske modellen

Den eksperimentelle mikroorganismen som ble brukt av François Jacob og Jacques Monod var den vanlige laboratoriebakterien, E. coli , men mange av de grunnleggende regulatoriske begrepene som ble oppdaget av Jacob og Monod er grunnleggende for mobilregulering i alle organismer. Nøkkeltanken er at proteiner ikke syntetiseres når de ikke er nødvendige - E. coli sparer mobilressurser og energi ved ikke å lage de tre Lac -proteinene når det ikke er behov for å metabolisere laktose, for eksempel når andre sukkerarter som glukose er tilgjengelige. Den følgende delen diskuterer hvordan E. coli kontrollerer visse gener som svar på metabolske behov.

Under andre verdenskrig testet Monod effekten av kombinasjoner av sukker som næringskilder for E. coli og B. subtilis . Monod fulgte opp lignende studier som hadde blitt utført av andre forskere med bakterier og gjær. Han fant ut at bakterier dyrket med to forskjellige sukkerarter ofte viste to faser av vekst. For eksempel, hvis både glukose og laktose ble gitt, ble glukose metabolisert først (vekstfase I, se figur 2) og deretter laktose (vekstfase II). Laktose ble ikke metabolisert i løpet av den første delen av den diauxiske vekstkurven fordi β-galaktosidase ikke ble laget når både glukose og laktose var tilstede i mediet. Monod kalte dette fenomenet diauxie .

Figur 2: Monods "bifasiske" vekstkurve

Monod fokuserte deretter sin oppmerksomhet på induksjon av β-galaktosidasedannelse som oppstod da laktose var det eneste sukkeret i kulturmediet.

Klassifisering av regulatoriske mutanter

Et konseptuelt gjennombrudd av Jacob og Monod var å gjenkjenne skillet mellom regulerende stoffer og steder der de virker for å endre genuttrykk. En tidligere soldat, Jacob brukte analogien til et bombefly som ville frigjøre sin dødelige last ved mottak av en spesiell radiooverføring eller signal. Et fungerende system krever både en jordsender og en mottaker i flyet. Anta at den vanlige senderen er ødelagt. Dette systemet kan få det til å fungere ved introduksjon av en andre, funksjonell sender. I kontrast, sa han, bør du vurdere en bombefly med en defekt mottaker. Atferden til denne bombeflyet kan ikke endres ved introduksjon av et andre, funksjonelt fly.

For å analysere regulatoriske mutanter av lac operon utviklet Jacob et system der en andre kopi av lac -genene ( lacI med dens promoter og lacZYA med promotor og operator) kunne introduseres i en enkelt celle. En kultur av slike bakterier, som er diploide for lac -genene, men ellers normale, blir deretter testet for den regulatoriske fenotypen. Spesielt er det bestemt om LacZ og LacY er laget selv i fravær av IPTG (på grunn av at laktoserepressoren produsert av mutantgenet er ikke-funksjonell). Dette eksperimentet, der gener eller genklynger testes parvis, kalles en komplementeringstest .

Lac complementation.png

Denne testen er illustrert i figuren ( lacA er utelatt for enkelhets skyld). Først vises visse haploide tilstander (dvs. cellen bærer bare en enkelt kopi av lac -genene). Panel (a) viser undertrykkelse, (b) viser induksjon av IPTG, og (c) og (d) viser effekten av en mutasjon til henholdsvis lacI -genet eller til operatøren. I panel (e) er komplementeringstesten for repressor vist. Hvis en kopi av lac -genene bærer en mutasjon i lacI , men den andre kopien er villtype for lacI , er den resulterende fenotypen normal - men lacZ uttrykkes når den utsettes for induserende IPTG. Mutasjoner som påvirker repressor sies å være recessive for villtype (og at villtype er dominerende ), og dette forklares med at repressor er et lite protein som kan diffundere i cellen. Kopien av lac operon ved siden av det defekte lacI -genet blir effektivt stengt av protein produsert fra den andre kopien av lacI .

Hvis det samme eksperimentet utføres ved bruk av en operatormutasjon, oppnås et annet resultat (panel (f)). Fenotypen til en celle som bærer en mutant og en villtype operatørsted er at LacZ og LacY produseres selv i fravær av induktoren IPTG; fordi det skadede operatørstedet ikke tillater binding av repressoren for å hemme transkripsjon av strukturgenene. Operatormutasjonen er dominerende. Når operatørstedet der repressoren må binde blir skadet av mutasjon, gjør tilstedeværelsen av et andre funksjonelt sted i den samme cellen ingen forskjell for uttrykk for gener kontrollert av mutantstedet.

En mer sofistikert versjon av dette eksperimentet bruker markerte operoner til å skille mellom de to kopiene av lac -genene og vise at det / de uregulerte strukturelle genet (er) er (er) ved siden av mutantoperatøren (panel (g). Anta for eksempel at en kopi er merket av en mutasjon som inaktiverer lacZ slik at den bare kan produsere LacY -proteinet, mens den andre kopien bærer en mutasjon som påvirker lacY og bare kan produsere LacZ. I denne versjonen er det bare kopien av lac operon som er ved siden av den mutante operatøren uttrykkes uten IPTG. Vi sier at operatormutasjonen er cis-dominerende , den er dominerende for villtype, men påvirker bare kopien av operonet som ligger like ved den.

Denne forklaringen er misvisende i en viktig forstand, fordi den utgår fra en beskrivelse av eksperimentet og deretter forklarer resultatene i form av en modell. Men faktisk er det ofte sant at modellen kommer først, og et eksperiment er laget spesielt for å teste modellen. Jacob og Monod forestilte seg først at det må være et sted i DNA med operatørens egenskaper, og designet deretter komplementeringstestene for å vise dette.

Dominansen av operatormutanter foreslår også en prosedyre for å velge dem spesifikt. Hvis regulatoriske mutanter velges fra en villtype-kultur ved bruk av fenyl-Gal, som beskrevet ovenfor, er operatormutasjoner sjeldne sammenlignet med repressormutanter fordi målstørrelsen er så liten. Men hvis vi i stedet starter med en stamme som bærer to kopier av hele lac -regionen (det er diploid for lac ), blir ikke repressormutasjonene (som fortsatt forekommer) gjenopprettet fordi komplementering av det andre villtype lacI -genet gir en villtype fenotype. I kontrast gir mutasjon av en kopi av operatøren en mutant fenotype fordi den er dominerende for den andre villtypekopien.

Regulering med syklisk AMP

Forklaring av diauxie var avhengig av karakteriseringen av ytterligere mutasjoner som påvirker andre lac -gener enn de som er forklart av den klassiske modellen. To andre gener, cya og crp , ble senere identifisert som kartlagt langt fra lac , og som, når de er mutert, resulterer i et redusert ekspresjonsnivå i nærvær av IPTG og til og med i stammer av bakterien som mangler repressoren eller operatøren. Funnet av cAMP i E. coli førte til demonstrasjonen av at mutanter som defekte cya -genet, men ikke crp -genet, kunne gjenopprettes til full aktivitet ved tilsetning av cAMP til mediet.

Den cya -genet koder for adenylatcyklase, som produserer cAMP. I en cya -mutant gjør fraværet av cAMP uttrykket for lacZYA -genene mer enn ti ganger lavere enn normalt. Tilsetning av cAMP korrigerer det lave Lac -uttrykket som er karakteristisk for cya -mutanter. Det andre genet, crp , koder for et protein kalt catabolite activator protein (CAP) eller cAMP reseptorprotein (CRP).

Imidlertid laktosemetabolismenzymer fremstilles i små mengder i nærvær av både glukose og laktose (noen ganger kalt utett uttrykk) på grunn av det faktum at LacI -repressoren raskt assosierer/dissosierer fra DNA i stedet for tett binding til det, noe som kan gi tid for RNAP å binde og transkribere mRNA av lacZYA . Lekkende uttrykk er nødvendig for å tillate metabolisme av litt laktose etter at glukosekilden er brukt, men før lac -uttrykk er fullt aktivert.

Oppsummert:

  • Når laktose er fraværende, er det svært lite Lac -enzymproduksjon (operatøren har Lac -repressor bundet til den).
  • Når laktose er tilstede, men en foretrukket karbonkilde (som glukose) også er tilstede, produseres en liten mengde enzym (Lac -repressor er ikke bundet til operatøren).
  • Når glukose mangler, binder CAP-cAMP seg til et spesifikt DNA-sted oppstrøms promotoren og utfører en direkte protein-protein-interaksjon med RNAP som letter bindingen av RNAP til promotoren.

Forsinkelsen mellom vekstfasene gjenspeiler tiden det tar å produsere tilstrekkelige mengder laktosemetaboliserende enzymer. Først må CAP -reguleringsproteinet samles på lac -promotoren, noe som resulterer i en økning i produksjonen av lac mRNA . Flere tilgjengelige kopier av lac mRNA resulterer i produksjon (se oversettelse ) av betydelig flere kopier av LacZ (β-galaktosidase, for laktosemetabolisme) og LacY (laktosepermease for å transportere laktose inn i cellen). Etter en forsinkelse som er nødvendig for å øke nivået av laktosemetaboliserende enzymer, går bakteriene inn i en ny rask fase av cellevekst .

lac operon i detalj

To gåter om katabolittundertrykkelse relaterer seg til hvordan cAMP -nivåer er koblet til tilstedeværelsen av glukose, og for det andre hvorfor cellene til og med skal bry seg. Etter at laktose er spaltet danner det faktisk glukose og galaktose (omdannes lett til glukose). I metabolske termer er laktose en like god karbon- og energikilde som glukose. CAMP -nivået er ikke relatert til intracellulær glukosekonsentrasjon, men til hastigheten for glukosetransport, som påvirker aktiviteten til adenylatsyklase. (I tillegg fører glukosetransport også til direkte hemming av laktosepermeasen.) Hvorfor E. coli fungerer på denne måten kan man bare spekulere i. Alle enteriske bakterier gjærer glukose, noe som tyder på at de støter på det ofte. Det er mulig at en liten forskjell i effektivitet av transport eller metabolisme av glukose v. Laktose gjør det fordelaktig for celler å regulere lac operon på denne måten.

Bruk i molekylærbiologi

Den lac -genet og dets derivater er egnet for bruk som et reportergen i et stort antall bakteriebaserte utvalg teknikker, slik som to-hybrid -analyse, hvor vellykket binding av en transkripsjonen aktivator i en spesifikk promoter sekvens må bestemmes. I LB- plater som inneholder X-gal , tilsvarer fargeendringen fra hvite kolonier til en blå nyanse omtrent 20–100 β-galaktosidaseenheter, mens tetrazoliumlaktose og MacConkey-laktosemedier har et område på 100–1000 enheter, og er mest følsomme i de høye og lave delene av dette området. Siden MacConkey laktose og tetrazolium laktose media begge er avhengige av produkter av laktose sammenbrudd, de krever tilstedeværelse av både lacZ og Lacy gener. De mange lac- fusjonsteknikkene som bare inkluderer lacZ- genet, er dermed egnet for X-gal-plater eller ONPG- væskebuljonger.

Se også

Referanser

Eksterne linker