Cyanidioschyzon -Cyanidioschyzon
| Cyanidioschyzon | |
|---|---|
|
|
Vitenskapelig klassifisering 
|
|
| (uten rangering): | Archaeplastida |
| Inndeling: | Rhodophyta |
| Klasse: | Cyanidiophyceae |
| Rekkefølge: | Cyanidiales |
| Familie: | Cyanidiaceae |
| Slekt: | Cyanidioschyzon |
| Arter: |
C. merolae
|
| Binomisk navn | |
|
Cyanidioschyzon merolae P. de Luca, R. Taddei & L. Varano, 1978
|
|
Cyanidioschyzon merolae er en liten (2μm), klubbformet, encellet haploid rødalge tilpasset høy svovel sure varme kilder (pH 1,5, 45 ° C). Den cellulære arkitekturen til C. merolae er ekstremt enkel, inneholder bare en enkelt kloroplast og en enkelt mitokondrion og mangler vakuol og cellevegg . I tillegg kan mobil- og organeldivisjonene synkroniseres. Av disse grunneneregnes C. merolae som et utmerket modellsystem for studier av cellulære og organelle divisjonsprosesser, samt biokjemi og strukturbiologi . Organismens genom var det første fullalgengenomet som ble sekvensert i 2004; dets plastid ble sekvensert i 2000 og 2003, og mitokondrion i 1998. Organismen har blitt ansett som den enkleste av eukaryote celler for sin minimalistiske cellulære organisasjon.
Isolasjon og vekst i kulturen
Opprinnelig isolert av De Luca i 1978 fra solfatane fumaroles av Campi Flegrei ( Napoli, Italia ), kan C. merolae dyrkes i kultur i laboratoriet i Modified Allen's medium (MA) eller en modifisert form med dobbelt konsentrasjon av noen elementer kalt MA2. Ved bruk av MA -medium er vekstrater ikke spesielt raske, med en doblingstid (tiden det tar en kultur av mikrober å doble i celler per volumenhet) på omtrent 32 timer. Ved å bruke det mer optimale mediet MA2 kan dette reduseres til 24 timer. Dyrking utføres ved 42 ° C under hvitt fluorescerende lys med en omtrentlig intensitet på 50 µmol fotoner m −2 s −1 (µE). Under en høyere lysintensitet på 90 µE med 5% CO 2 påført gjennom bobler, kan veksthastigheten for C. merolae imidlertid økes ytterligere, med en doblingstid på omtrent 9,2 timer. Høyere lys er ikke nødvendigvis gunstig, ettersom veksten over 90 µE begynner å synke. Dette kan skyldes fotoskader i det fotosyntetiske apparatet. C. merolae kan også dyrkes på gellangummi -plater for valg av kolonier eller vedlikehold av belastninger i laboratoriet. C. merolae er en obligatorisk oksygenisk fototrof , noe som betyr at den ikke er i stand til å ta opp fast karbon fra omgivelsene og må stole på oksygenisk fotosyntese for å fikse karbon fra CO 2 .
Genom
16,5 megabaseparets genom av C. merolae ble sekvensert i 2004. Det reduserte, ekstremt enkle, kompakte genomet består av 20 kromosomer og ble funnet å inneholde 5.331 gener, hvorav 86,3% viste seg å være uttrykt og bare 26 inneholder introner , som inneholdt strenge konsensus -sekvenser. Påfallende nok inneholder genomet til C. merolae bare 30 tRNA -gener og et ekstremt minimalt antall ribosomale RNA -genkopier , som vist i genomets sammenligningstabell . Den reduserte arten av genomet har ført til flere andre uvanlige trekk. Mens de fleste eukaryoter inneholder omtrent 10 kopier av dynaminene som kreves for å klemme membraner i separate delingsrom, inneholder C. merolae bare to, et faktum som forskere har utnyttet når de studerer organeldeling.
Selv om kloroplastgenomet til C. merolae har et lite genom, inneholder det mange gener som ikke finnes i kloroplastgener fra andre alger og planter. De fleste av genene er intronløse.
Molekylbiologi
Som tilfellet er med de fleste modellorganismer, er det utviklet genetiske verktøy i C. merolae . Disse inkluderer metoder for isolering av DNA og RNA fra C. merolae , introduksjon av DNA i C. merolae for forbigående eller stabil transformasjon, og metoder for seleksjon inkludert en uracil auxotroph som kan brukes som seleksjonsmarkør.
DNA -isolasjon
Flere metoder, avledet fra cyanobakterielle protokoller, brukes for isolering av DNA fra C. merolae . Den første er en varm fenolekstraksjon , som er en rask ekstraksjon som kan brukes til å isolere DNA egnet for DNA -amplifikasjon polymerasekjedereaksjon (PCR), hvor fenol tilsettes hele celler og inkuberes ved 65 ° C for å ekstrahere DNA. Hvis det kreves renere DNA, kan metoden Cetyl trimethyl ammonium bromide (CTAB) brukes. I denne metoden påføres først en ekstraksjonsbuffer med høyt salt og celler blir forstyrret, hvoretter en kloroform-fenolblanding brukes til å ekstrahere DNA ved romtemperatur.
RNA -isolasjon
Totalt RNA kan ekstraheres fra C. merolae -celler ved bruk av en variant av den varme fenolmetoden beskrevet ovenfor for DNA.
Proteinekstraksjon
Som tilfellet er med DNA og RNA, er protokollen for proteinextraksjon også en tilpasning av protokollen som brukes i cyanobakterier. Celler blir forstyrret ved bruk av glassperler og virvling i en 10% glyserolbuffer som inneholder reduksjonsmidlet DTT for å bryte disulfidbindinger i proteiner. Denne ekstraksjonen vil resultere i denaturerte proteiner , som kan brukes i SDS-PAGE- geler for Western blotting og Coomassie- farging.
Transformantvalg og uracil auxotrofisk linje
C. merolae er følsom for mange antibiotika som vanligvis brukes for valg av vellykkede transformerte individer i laboratoriet, men det er motstandsdyktig mot noen, særlig ampicillin og kanamycin .
En vanlig seleksjonsmarkør for transformasjon i C. merolae involverer en uracil auxotroph (krever eksogen uracil). Mutanten ble utviklet ved å dyrke C. merolae i nærvær av en forbindelse, 5-FOA, som i seg selv er giftfri, men omdannes til den giftige forbindelsen 5-Fluorouracil av et enzym i uracil biosyntetisk vei, orotidin 5 '-monofosfat (OMP) dekarboksylase , kodet av Ura5.3- genet. Tilfeldig mutasjon førte til flere funksjonshemmede mutanter i Ura5.3 , som tillot celler å overleve i nærvær av 5-FOA så lenge uracil ble gitt. Ved å transformere denne mutanten med et PCR -fragment som bærer både et gen av interesse og en funksjonell kopi av Ura5.3 , kan forskere bekrefte at genet av interesse er blitt inkorporert i C. merolae -genomet hvis det kan vokse uten eksogent uracil.
Polyetylenglykol (PEG) mediert forbigående uttrykk
Mens kromosomal integrering av gener skaper en stabil transformant, tillater forbigående uttrykk at kortsiktige eksperimenter kan utføres ved bruk av merkede eller modifiserte gener i C. merolae . Forbigående ekspresjon kan oppnås ved bruk av en polyetylenglykol (PEG) basert metode i protoplaster (planteceller med stiv cellevegg enzymatisk eliminert), og fordi C. merolae mangler en cellevegg, oppfører den seg mye som en protoplast ville ha for transformasjonsformål. For å transformere blir celler kort eksponert for 30% PEG med DNA av interesse, noe som resulterer i forbigående transformasjon. I denne metoden tas DNA opp som et sirkulært element og er ikke integrert i genomet til organismen fordi det ikke finnes homologe regioner for integrering.
Genmålretting
For å skape en stabil mutantlinje kan genmålretting brukes til å sette inn et gen av interesse i et bestemt sted for C. merolae -genomet via homolog rekombinasjon . Ved å inkludere områder av DNA som er flere hundre basepar lange på enden av genet av interesse som er komplementære til en sekvens i C. merolae -genomet , kan organismenes eget DNA -reparasjonsmaskineri brukes til å sette inn genet ved disse områdene. Den samme transformasjonsprosedyren som brukes for forbigående ekspresjon kan brukes her, unntatt med de homologe DNA -segmentene for å tillate genomintegrasjon.
.jpg)
Studerer celle- og organeldivisjoner
Den ekstremt enkle splittende, enkle cellearkitekturen og muligheten til å synkronisere divisjoner i C. merolae gjør den til den perfekte organismen for å studere mekanismer for eukaryote celle- og organeldeling. Synkronisering av organelles inndeling i dyrkede celler kan være veldig enkel og innebærer vanligvis bruk av lyse og mørke sykluser. Det kjemiske middelet aphidicolin kan tilsettes for å enkelt og effektivt synkronisere kloroplastdeling. Den peroksisom divisjon mekanismen ble først vurdert ved bruk C. merolae som et system, hvor peroksisom delingen kan synkroniseres ved hjelp av mikrotubuli -disrupting medikament oryzalin i tillegg til lys-mørke-sykluser.
Fotosynteseforskning
C. merolae brukes også i forskning på fotosyntese . Spesielt har underenhetens sammensetning av fotosystemene i C. merolae noen betydelige forskjeller fra andre relaterte organismer. Fotosystem II (PSII) av C. merolae , som man kan forvente, har et spesielt uvanlig pH -område der det kan fungere. Til tross for at mekanismen til PSII krever at protoner frigjøres raskt, og løsninger med lavere pH bør endre evnen til å gjøre dette, er C. merolae PSII i stand til å utveksle og dele vann i samme hastighet som andre beslektede arter.
Se også
Eksterne linker
Guiry, MD; Guiry, GM (2008). "' Cyanidioschyzon merolae' " . AlgeeBase . Verdensomspennende elektronisk publikasjon, National University of Ireland, Galway.