c -Raf - c-Raf
RAF proto-onkogen serin/treonin-proteinkinase, også kjent som proto-onkogen c-RAF eller ganske enkelt c-Raf eller til og med Raf-1, er et enzym som hos mennesker er kodet av RAF1- genet . C-Raf-proteinet er en del av ERK1/2-banen som en MAP-kinase (MAP3K) som fungerer nedstrøms for Ras-underfamilien til membranassosierte GTPaser. C-Raf er medlem av Raf kinasefamilien av serin/treoninspesifikke proteinkinaser , fra TKL (Tyrosin-kinase-lignende) kinasegruppe.
Oppdagelse
Den første Raf-genet, v-Raf ble funnet på 1983. Den ble isolert fra de murine retrovirus som bærer nummer 3611. Det ble snart vist å være i stand til å transformere gnager fibroblaster til cancercellelinjer , så dette gen ble gitt navnet Virus- indusert raskt akselerert fibrosarkom (V-RAF). Et år senere ble det funnet et annet transformerende gen i aviær-retroviruset MH2, kalt v-Mil-som viste seg å være veldig likt v-Raf. Forskere kunne demonstrere at disse genene koder for enzymer som har serintreoninkinaseaktivitet. Normale mobilhomologer av v-Raf og v-Mil ble snart funnet i både mus- og kyllingegenomet (derav navnet c-Raf for det normale cellulære Raf-genet), og det ble klart at også disse hadde en rolle i å regulere vekst og celledeling. Nå vet vi at c-Raf er en hovedkomponent i den første beskrevne mitogenaktiverte proteinkinasen (MAPK) banen: ERK1/2-signalering . Det fungerer som en MAP3 -kinase og starter hele kinasekaskaden. Påfølgende eksperimenter viste at de normale, cellulære Raf -genene også kan mutere til å bli onkogener, ved å "overdrive" MEK1/2 og ERK1/2 -aktivitet. Faktisk inneholder vertebratgenomer flere Raf -gener. Flere år senere etter oppdagelsen av c-Raf ble to ytterligere relaterte kinaser beskrevet: A-Raf og B-Raf . Sistnevnte ble fokus for forskning de siste årene, siden en stor del av menneskelige svulster bærer onkogene 'driver' mutasjoner i B-Raf genet. Disse mutasjonene induserer en ukontrollert, høy aktivitet av Raf -enzymer. Dermed nådde diagnostisk og terapeutisk interesse for Raf kinaser en ny topp de siste årene.
Struktur
Det humane c-Raf-genet ligger på kromosom 3 . Minst to isoformer av mRNA er beskrevet (som følge av inkludering eller fjerning av et alternativt ekson ) som bare viser små forskjeller. Den kortere, store isoformen - som består av 17 eksoner - koder for en proteinkinase på 648 aminosyrer.
På samme måte som mange andre MAPKKK-er , er c-Raf et multidomain-protein , med flere domener som hjelper til med å regulere katalytisk aktivitet. På sitt N-terminalsegment finnes et Ras-bindende domene (RBD) og et C-kinase-homologt domene 1 (C1-domene) ved siden av hverandre. Strukturer for begge bevarte domener ble løst de siste tiårene, og belyste mekanismene for deres regulering.
De Ras-bindende domene viser et ubiquitin-lignende fold (som mange andre liten G-protein assosierende domener) og selektivt binder GTP-bundne Ras-proteiner kun. (Du kan se denne interaksjonen i detalj i PDB-boksen som er vedlagt artikkelen. Den viser Rap1 i kompleks med RBD for c-Raf.)
Den C1 domene - umiddelbart nedstrøms for Ras bindingsdomene - er en spesiell zinkfinger , rik på cysteiner og stabilisert ved hjelp av to sinkioner. Det ligner på de diacylglyserolbindende C1-domenene til proteinkinase C (PKC) enzymer. Men i motsetning til PKC, binder ikke C1 -domenene til Raf -familiens kinaser diacylglyserol. I stedet interagerer de med andre lipider, for eksempel ceramid eller fosfatidsyre, og hjelper til og med med å gjenkjenne aktivert Ras (GTP-Ras).
Nærheten til disse to domenene samt flere linjer med eksperimentelle data antyder at de fungerer som en enkelt enhet for å regulere aktiviteten til proteinkinasedomenet negativt, ved direkte fysisk interaksjon. Historisk sett ble denne autoinhibitoriske blokken merket som CR1 -regionen ("Conserved Region 1"), hengselområdet ble kalt CR2 og kinasedomenet CR3. Dessverre er den nøyaktige strukturen til den autoinhiberte kinasen ukjent.
Mellom den autoinhibitoriske domeneblokken og det katalytiske kinasedomenet kan man finne et langt segment - karakteristisk for alle Raf -proteiner. Den er sterkt beriket med serinaminosyrer , men dens presise sekvens er dårlig konservert på tvers av beslektede Raf -gener. Denne regionen ser ut til å være iboende ustrukturert og veldig fleksibel. Den mest sannsynlige rollen er å fungere som et naturlig "hengsel" mellom de stivt brettede autoinhibitoriske og katalytiske domenene, noe som muliggjør komplekse bevegelser og dype konformasjonelle omorganiseringer i molekylet. Denne hengselregionen inneholder en liten, bevart øy av aminosyrer, som er ansvarlige for 14-3-3 proteingjenkjenning , men bare når en kritisk serin (Ser259 i human c-Raf) fosforyleres. Et annet, lignende motiv finnes på den ekstreme C-terminalen (sentrert rundt den fosforylerbare Ser 621) for alle Raf-enzymer, men nedstrøms kinasedomene.
Den C-terminale halvdelen av c-Raf bretter seg til et enkelt proteindomene, ansvarlig for katalytisk aktivitet. Strukturen til dette kinasedomenet er velkjent fra både c-Raf og B-Raf. Det ligner veldig på andre Raf -kinaser og KSR -proteiner, og ligner tydelig på noen andre MAP3 -kinaser, for eksempel Mixed Lineage Kinase (MLK) -familien. Sammen utgjør de Tyrosine Kinase Like (TKL) gruppen av proteinkinaser. Selv om noen funksjoner forener deres katalytiske domener med proteintyrosinkinaser, er aktiviteten til TKL begrenset til fosforylering av serin- og treoninrester i målproteiner. Det viktigste substratet for Raf -kinaser (bortsett fra seg selv) er MKK1- og MKK2 -kinasene , hvis aktivitet strengt tatt avhenger av fosforyleringshendelser utført av Rafs.
Evolusjonære forhold
Human c-Raf er medlem av en større familie av beslektede proteinkinaser. Ytterligere to medlemmer - funnet hos de fleste virveldyr - tilhører samme familie: B -Raf og A -Raf . Bortsett fra den forskjellige lengden på deres ikke-bevarte N- og C-terminalender, deler de alle samme domenearkitektur, struktur og regulering. Sammenlignet med de relativt kjente c-Raf og B-Raf, er det svært lite kjent om A-Rafs presise funksjon, men det antas også å ligne de to andre familiemedlemmene. Alle disse genene antas å være et produkt av fullstendig gen- eller genomduplisering ved begynnelsen av vertebratutviklingen, fra et enkelt forfedre Raf -gen. De fleste andre dyreorganismer har bare et enkelt Raf -gen. Det kalles Phl eller Draf i Drosophila og Lin-45 i C. elegans.
Flercellede dyr har også en type kinase nært knyttet til Raf: dette er Kinase Suppressor of Ras (KSR). Virveldyr som pattedyr har to, paraloge KSR -gener i stedet for ett: KSR1 og KSR2 . Deres C-terminale kinasedomen er veldig lik Raf (opprinnelig kalt CA5 i KSR og CR3 i Raf), men den N-terminale reguleringsregionen er forskjellig. Selv om de også har det fleksible hengslet (CA4 i KSR) og et C1-domene (CA3 i KSR) før det, mangler KSR helt og holdent det Ras-bindende domenet. I stedet har de unike regulatoriske regioner på N-termini, opprinnelig betegnet CA1 ("bevaret område 1") og CA2. I lang tid var strukturen til CA1 -domenet et mysterium. I 2012 ble imidlertid strukturen til CA1-regionen i KSR1 løst: det viste seg å være et divergerende SAM (sterilt alfamotiv) domene, supplert med spolede spoler (CC-SAM): dette skal hjelpe KSR i membran bindende. KSR-er, som Rafs, har også de to 14-3-3-assosierende motivene (som avhenger av fosforylering), men har også nye MAPK-bindende motiver på hengselområdene. Med en typisk Phe-x-Phe-Pro (FxFP) sekvens er disse motivene viktige for tilbakemeldingsreguleringen av Raf kinaser i ERK1/2-banen . I henhold til vår nåværende kunnskap, deltar KSR også på samme vei som Raf, selv om de bare spiller en tilleggsrolle. Med en veldig dårlig iboende kinaseaktivitet, ble de lenge antatt å være inaktive, til deres katalytiske aktivitet endelig ble demonstrert de siste årene. Men selv da bidrar de bare ubetydelig til MKK1 og MKK2 fosforylering. Hovedrollen til KSR ser ut til å være å tilby en heterodimeriseringspartner til Raf -enzymer, noe som i stor grad muliggjør deres aktivering ved hjelp av allostery. Lignende fenomener ble beskrevet for andre MAP3 -kinaser. ASK2, for eksempel, er et dårlig enzym i seg selv, og aktiviteten ser ut til å være knyttet til ASK1/ASK2 -heterodimerisering.
Raf-lignende kinaser er fullstendig fraværende fra sopp. Men nylig sekvensering av andre opisthokonts (f.eks. Capsaspora owczarzaki ) avslørte tilstedeværelsen av ekte Raf -kinaser i encellede eukaryoter. Derfor er det mulig at Raf-proteiner er en gammel arv og forfedre til sopp mistet sekundært Raf-avhengig signalering. Sopp- MAP- kinaseveier som er homologe med pattedyrs ERK1/2-banen (Fus3 og Kss1 i gjær) aktiveres av MEKK-relaterte kinaser (f.eks. Ste11 i gjær) i stedet for Raf-enzymer.
Raf kinaser funnet i retrovirus (som murine v-Raf) er sekundært avledet fra de tilsvarende vertebratgenene til vertene. Disse Raf-genene koder for sterkt avkortede proteiner, som mangler hele det N-terminale autoinhibitoriske domenet, og de 14-3-3 bindende motivene. Slike alvorlige avkortninger er kjent for å indusere en ukontrollert aktivitet av Raf kinaser: det er akkurat det et virus kan trenge for effektiv reproduksjon.
Regulering av aktivitet
Som nevnt ovenfor er reguleringen av c-Raf-aktivitet kompleks. Som en "portvakt" for ERK1/2 -banen holdes den i sjakk av en rekke hemmende mekanismer, og kan normalt ikke aktiveres i et enkelt trinn. Den viktigste reguleringsmekanismen innebærer direkte, fysisk tilknytning av den N-terminale autoinhibitoriske blokken til kinasedomenet til c-Raf. Det resulterer i okklusjon av det katalytiske stedet og fullstendig avstengning av kinaseaktivitet. Denne "lukkede" tilstanden kan bare lindres hvis det autoinhibitoriske domenet til Raf engasjerer en partner som konkurrerer med sitt eget kinasedomene, viktigst av GTP-bundet Ras. Aktiverte små G-proteiner kan dermed bryte opp de intramolekylære interaksjonene: dette resulterer i en konformasjonsendring ("åpning") av c-Raf som er nødvendig for kinaseaktivering og substratbinding.
14-3-3 proteiner bidrar også til autoinhibisjonen. Siden 14-3-3 proteiner alle er kjent for å danne konstituerende dimerer, har deres sammensetninger to bindingssteder. Dermed fungerer dimeren som en "molekylær håndjern", som låser deres bindingspartnere i en fast avstand og orientering. Når de nøyaktig plasserte tvilling 14-3-3 bindingsmotivene blir engasjert av en enkelt 14-3-3 proteindimer (for eksempel 14-3-3 zeta), blir de låst fast i en konformasjon som fremmer autoinhibering og ikke tillater frakobling av de autoinhibitoriske og katalytiske domenene. Denne "lockdown" av c-Raf (og andre Rafs samt KSR) er kontrollert av motivfosforylering. Ufosforylerte 14-3-3 assosierende motiver binder ikke partnerne sine: de må fosforyleres på konserverte seriner (Ser 259 og Ser 621) først, av andre proteinkinaser. Den viktigste kinasen som er involvert i denne hendelsen er TGF-beta-aktivert kinase 1 (TAK1), og enzymene dedikert til fjerning av disse fosfatene er proteinfosfatase 1 (PP1) og proteinfosfatase 2A (PP2A) komplekser.
Vær oppmerksom på at 14-3-3-binding av Raf-enzymer ikke nødvendigvis er hemmende: Når Raf først er åpen og dimererer, kan 14-3-3s også binde seg i trans , bygge bro mellom to kinaser og "håndjern" dem sammen for å forsterke dimeren, i stedet for holde dem borte fra hverandre. Ytterligere moduser for 14-3-3 interaksjoner med c-Raf eksisterer også, men deres rolle er ikke godt kjent.
Dimerisering er en annen viktig mekanisme for regulering av c-Raf-aktivitet og nødvendig for fosforylering av Raf- aktiveringssløyfe . Normalt er det bare de "åpne" kinasedomenene som deltar i dimerisering. I motsetning til B-Raf, som lett danner homodimerer med seg selv, foretrekker c-Raf heterodimerisering med enten B-Raf eller KSR1. Homodimere og heterodimere oppfører seg alle på samme måte. B-Raf-homodimerkinasedomenestrukturen viser tydelig at aktiveringssløyfene (som styrer den katalytiske aktiviteten til alle kjente proteinkinaser) er plassert i en aktivlignende konformasjon i dimeren. Dette skyldes en allosterisk effekt av det andre molekylet som binder seg til "baksiden" av kinasen; slike dimerer er symmetriske og har to, delvis aktive katalytiske seter. På dette stadiet er aktiviteten til Raf kinaser lav og ustabil.
For å oppnå full aktivitet og stabilisere den aktive tilstanden, må aktiveringssløyfen til c-Raf fosforyleres. De eneste kinasene som for tiden er kjent for å utføre denne handlingen er Raf -familien kinaser selv. Men noen andre kinaser, for eksempel PAK1, kan fosforylere andre rester i nærheten av kinasedomenet til c-Raf: den presise rollen til disse hjelpekinasene er ukjent. I sammenheng med c-Raf er både c-Raf og KSR1 nødvendig for trinnet "transfosforylering". På grunn av dimerenes arkitektur kan denne fosforyleringen bare skje i trans (dvs. en dimer fosforylerer en annen, i et overledende kompleks med fire ledd). Ved å samhandle med konserverte Arg- og Lys -rester i kinasedomenet, skifter de fosforylerte aktiveringssløyfene konformasjonen og blir ordnet, og låser kinasedomenet permanent til en fullt aktiv tilstand til det defosforyleres. De fosforylerte aktiveringssløyfene gjør også kinasen ufølsom for tilstedeværelsen av dens autoinhibitoriske domene. KSR -er kan ikke gjennomgå dette siste trinnet ettersom de savner fosforylerbare rester i aktiveringssløyfene. Men når c-Raf er fullstendig aktivert, er det ikke nødvendig å gjøre det: aktive Raf-enzymer kan nå koble til substratene sine. Som de fleste proteinkinaser har c-Raf flere substrater. BAD (BCL2-atagonist av celledød) er direkte fosforylert av c-Raf, sammen med flere typer av adenylat cyclases , myosin fosfatase (MYPT), hjertemuskelen troponin T (TnTc) etc. retinoblastoma protein (pRb) og cdc25 fosfatase ble også foreslått som mulige underlag.
De viktigste målene for alle Raf -enzymer er MKK1 (MEK1) og MKK2 (MEK2) . Selv om strukturen til enzym-substratkomplekset c-Raf: MKK1 er ukjent, kan den presist modelleres etter KSR2: MKK1-komplekset. Her finner ingen egentlig katalyse sted, men det antas å være svært likt måten Raf binder seg til sine underlag. Hovedinteraksjonsgrensesnittet er levert av C-terminallappene i begge kinasedomenene; den store, uordnede, prolinrike loop som er unik for MKK1 og MKK2 , spiller også en viktig rolle i posisjoneringen til Raf (og KSR). Disse MKK -ene fosforyleres på minst to steder i aktiveringssløyfene ved binding til Raf: dette vil også aktivere dem. Målene for kinasekaskaden er ERK1 og ERK2, som selektivt aktiveres av MKK1 eller MKK2. ERK har mange substrater i celler; de er også i stand til å translokere til kjernen for å aktivere kjernefysiske transkripsjonsfaktorer. Aktiverte ERK er pleiotropiske effektorer av cellefysiologi og spiller en viktig rolle i kontrollen av genuttrykk involvert i celledelingssyklusen, cellemigrasjon, inhibering av apoptose og celledifferensiering.
Tilknyttede sykdommer hos mennesker
Arvelige gain-of-function mutasjoner av c-Raf er implisert i noen sjeldne, men alvorlige syndromer. De fleste av disse mutasjonene involverer endringer i enkelt aminosyre ved et av de to bindingsmotivene 14-3-3. Mutasjon av c-Raf er en av de mulige årsakene til Noonan syndrom : berørte individer har medfødte hjertefeil, kort og dysmorfisk statur og flere andre deformiteter. Lignende mutasjoner i c-Raf kan også forårsake en beslektet tilstand, kalt LEOPARD syndrom (Lentigo, elektrokardiografiske abnormiteter, okulær hypertelorisme, lungestenose, unormale kjønnsorganer, forsinket vekst, døvhet), med en kompleks sammenslutning av defekter.
Rolle i kreft
Selv om c-Raf veldig klart er i stand til å mutere til et onkogen i eksperimentelle omgivelser, og til og med i noen få humane svulster, er søsterkinasen B-Raf den sanne hovedaktøren innen karsinogenese hos mennesker.
B-Raf mutasjoner
Omtrent 20% av alle undersøkte humane tumorprøver viser et mutert B-Raf-gen. Det overveldende flertallet av disse mutasjonene innebærer utveksling av en enkelt aminosyre: Val 600 til Glu, og dette avvikende genproduktet (BRAF -V600E) kan visualiseres ved immunhistokjemi for klinisk molekylær diagnostikk Aberrasjonen kan etterligne fosforylering av aktiveringssløyfen og - ved hoppe alle kontrolltrinn ved normal aktivering - umiddelbart gjøre kinasedomenet fullt aktivt. Siden B-Raf også kan aktivere seg selv ved homodimerisering og c-Raf ved heterodimerisering, har denne mutasjonen en katastrofal effekt ved å dreie ERK1/2-banen konstitutivt aktiv og drive en ukontrollert celledelingsprosess.
Som et terapeutisk mål
På grunn av viktigheten av både Ras- og B-Raf-mutasjoner i tumorigenese, ble flere Raf-hemmere utviklet for å bekjempe kreft, spesielt mot B-Raf som viser V600E-mutasjonen. Sorafenib var det første klinisk nyttige middelet, som gir et farmakologisk alternativ for å behandle maligniteter som tidligere var stort sett ubehandlet, som nyrecellekarsinom og melanom. Flere andre molekyler fulgte opp, for eksempel Vemurafenib , Regorafenib , Dabrafenib , etc.
Dessverre kan ATP-konkurransedyktige B-Raf-hemmere ha en uønsket effekt ved K-Ras-avhengige kreftformer: De er rett og slett for selektive for B-Raf. Selv om de godt hemmer B-Raf-aktiviteten i tilfelle en mutant B-Raf er den primære synderen, fremmer de også homo- og heterodimerisering av B-Raf, med seg selv og c-Raf. Dette vil faktisk forbedre c-Raf-aktiveringen i stedet for å hemme den i tilfelle det ikke er noen mutasjon i noen Raf-gener, men deres vanlige oppstrøms aktivator K-Ras-protein er det som er mutert. Denne "paradoksale" c-Raf-aktiveringen krever at det må screenes for B-Raf-mutasjoner hos pasienter (ved genetisk diagnostikk) før en B-Raf-hemmerbehandling starter.
Liste over interagerende proteiner
C-Raf har vist seg å samhandle med:
Se også
Referanser
Videre lesning
- Reed JC, Zha H, Aime-Sempe C, Takayama S, Wang HG (1997). "Struktur-funksjonsanalyse av Bcl-2-familieproteiner. Regulatorer for programmert celledød". Adv. Eksp. Med. Biol . 406 : 99–112. doi : 10.1007/978-1-4899-0274-0_10 . PMID 8910675 .
- Geyer M, Fackler OT, Peterlin BM (2001). "Struktur-funksjon-relasjoner i HIV-1 Nef" . EMBO Rep . 2 (7): 580–5. doi : 10.1093/embo-reports/kve141 . PMC 1083955 . PMID 11463741 .
- Dhillon AS, Kolch W (2002). "Å oppheve forskriften for Raf-1 kinase". Arch. Biochem. Biofys . 404 (1): 3–9. doi : 10.1016/S0003-9861 (02) 00244-8 . PMID 12127063 .
- Greenway AL, Holloway G, McPhee DA, Ellis P, Cornall A, Lidman M (2004). "HIV-1 Nef-kontroll av cellesignalmolekyler: flere strategier for å fremme virusreplikasjon". J. Biosci . 28 (3): 323–35. doi : 10.1007/BF02970151 . PMID 12734410 . S2CID 33749514 .
- Chen H, Kunnimalaiyaan M, Van Gompel JJ (2006). "Medullær kreft i skjoldbruskkjertelen: funksjonene til raf-1 og human achaete-scute homolog-1". Skjoldbrusk . 15 (6): 511–21. doi : 10.1089/thy.2005.15.511 . PMID 16029117 .
Eksterne linker
- GeneReviews/NCBI/NIH/UW oppføring om Noonan syndrom
- Domene struktur diagrammer for Raf-1, A-Raf og B-Raf.
- Drosophila stanghull - The Interactive Fly
- c-raf+Proteiner ved US National Library of Medicine Medical Subject Headings (MeSH)
- Menneskelig RAF1 genomlokalisering og RAF1 gen detaljer side i UCSC Genome Browser .
- Oversikt over all strukturell informasjon tilgjengelig i PDB for UniProt : P04049 (RAF proto-onkogen serin/treonin-proteinkinase) på PDBe-KB .
