Cytogenetikk - Cytogenetics

For det vitenskapelige tidsskriftet for denne tittelen, se Cytogenetic and Genome Research .
En metafasecelle positiv for BCR/ABL -omorganisering ved bruk av FISH

Cytogenetikk er i hovedsak en gren av genetikk , men er også en del av cellebiologi/cytologi (en underavdeling av menneskelig anatomi), som er opptatt av hvordan kromosomene forholder seg til celleoppførsel, spesielt til deres oppførsel under mitose og meiose . Teknikker som brukes inkluderer karyotyping , analyse av G-båndede kromosomer, andre cytogenetiske båndteknikker, samt molekylær cytogenetikk som fluorescerende in situ- hybridisering (FISH) og komparativ genomisk hybridisering (CGH).

Historie

Begynnelser

Kromosomer ble først observert i planteceller av Karl Wilhelm von Nägeli i 1842. Deres oppførsel i dyre ( salamander ) celler ble beskrevet av Walther Flemming , oppdageren av mitose , i 1882. Navnet ble laget av en annen tysk anatom, von Waldeyer i 1888 .

Det neste stadiet fant sted etter utviklingen av genetikk på begynnelsen av 1900 -tallet, da det ble verdsatt at settet med kromosomer ( karyotypen ) var bæreren av genene. Levitsky ser ut til å ha vært den første som definerte karyotypen som det fenotypiske utseendet til de somatiske kromosomene, i motsetning til deres geniske innhold. Det tok mange år å undersøke den menneskelige karyotypen for å avgjøre det mest grunnleggende spørsmålet: hvor mange kromosomer inneholder en normal diploid menneskelig celle? I 1912 rapporterte Hans von Winiwarter 47 kromosomer i spermatogoni og 48 i oogonia , og avsluttet en XX/XO kjønnsbestemmelsesmekanisme . Maleren i 1922 var ikke sikker på om det diploide antallet mennesker var 46 eller 48, først favoriserte 46. Han reviderte sin mening senere fra 46 til 48, og han insisterte riktig på at mennesker skulle ha et XX/XY- system for kjønnsbestemmelse. Med tanke på deres teknikker var disse resultatene ganske bemerkelsesverdige. I vitenskapelige bøker forble antallet menneskelige kromosomer på 48 i over tretti år. Nye teknikker var nødvendig for å rette opp denne feilen. Joe Hin Tjio som jobbet i Albert Levans laboratorium var ansvarlig for å finne fremgangsmåten:

  1. Bruke celler i kultur
  2. Forbehandling av celler i en hypoton løsning , som sveller dem og sprer kromosomene
  3. Stopping av mitose i metafase med en løsning av kolkisin
  4. Klemme preparatet på lysbildet og tvinge kromosomene til et enkelt plan
  5. Klippe opp et mikrofotografi og ordne resultatet til et udiskutabelt karyogram.

Det tok til 1956 før det ble generelt akseptert at karyotypen til mennesket bare inneholdt 46 kromosomer. De store aper har 48 kromosomer. Menneskelig kromosom 2 ble dannet ved en sammenslåing av forfedre kromosomer, noe som reduserte antallet.

Søknader innen cytogenetikk

McClintocks arbeid med mais

Barbara McClintock begynte sin karriere som mais cytogeneticist. I 1931 demonstrerte McClintock og Harriet Creighton at cytologisk rekombinasjon av markerte kromosomer korrelerte med rekombinasjon av genetiske egenskaper ( gener ). McClintock, mens han var ved Carnegie Institution , fortsatte tidligere studier om mekanismene for kromosombrudd og fusjonsbluss hos mais. Hun identifiserte en bestemt kromosombruddshendelse som alltid skjedde på det samme stedet på maiskromosom 9, som hun kalte " Ds" eller "dissosiasjon" -lokuset. McClintock fortsatte sin karriere innen cytogenetikk og studerte mekanikk og arv av ødelagte og ringformede (sirkulære) kromosomer av mais. Under sitt cytogenetiske arbeid oppdaget McClintock transposoner , et funn som til slutt førte til hennes Nobelpris i 1983.

Naturlige populasjoner av Drosophila

På 1930 -tallet samlet Dobzhansky og hans kolleger Drosophila pseudoobscura og D. persimilis fra ville populasjoner i California og nabolandene. Ved å bruke Malers teknikk studerte de polytenkromosomene og oppdaget at ville populasjoner var polymorfe for kromosomale inversjoner . Alle fluene ser like ut uansett hvilken inversjon de bærer: dette er et eksempel på en kryptisk polymorfisme.

Det samlet seg raskt bevis for at naturlig seleksjon var ansvarlig. Ved å bruke en metode oppfunnet av L'Héritier og Teissier, avlet Dobzhansky populasjoner i populasjonsbur , noe som muliggjorde fôring, avl og prøvetaking samtidig som det hindret rømning. Dette hadde fordelen av å eliminere migrasjon som en mulig forklaring på resultatene. Aksjer som inneholder inversjoner ved en kjent startfrekvens kan opprettholdes under kontrollerte forhold. Det ble funnet at de forskjellige kromosomtypene ikke svinger tilfeldig, slik de ville gjort hvis de var selektivt nøytrale, men tilpasset seg visse frekvenser der de ble stabilisert. Da Dobzhansky publiserte den tredje utgaven av boken hans i 1951, ble han overbevist om at kromosommorfene opprettholdes i befolkningen av den selektive fordelen med heterozygotene, som med de fleste polymorfismer .

Lilje og mus

Liljen er en foretrukket organisme for cytologisk undersøkelse av meiose siden kromosomene er store og hvert morfologiske stadium av meiose lett kan identifiseres mikroskopisk. Hotta, Chandley et al. presenterte bevis for et vanlig mønster for DNA -nicking og reparasjonssyntese i meiotiske mannlige celler av liljer og gnagere i løpet av zygoten -pachytene -stadiene av meiose når overgang skulle antas å forekomme. Tilstedeværelsen av et felles mønster mellom organismer så fylogenetisk fjernt som lilje og mus fikk forfatterne til å konkludere med at organisasjonen for meiotisk overgang i minst høyere eukaryoter sannsynligvis er universell i distribusjonen.

Menneskelige abnormiteter og medisinske applikasjoner

Philadelphia -translokasjon t (9; 22) (q34; q11.2) sett ved kronisk myelogen leukemi.

Etter ankomsten av prosedyrer som muliggjorde enkel oppregning av kromosomer, ble det raskt gjort funn relatert til avvikende kromosomer eller kromosomnummer. Ved noen medfødte lidelser, som Downs syndrom , avslørte cytogenetikk arten av den kromosomale defekten: en "enkel" trisomi. Unormaliteter som oppstår som følge av ikke -koblingshendelser , kan forårsake celler med aneuploidi (tillegg eller sletting av hele kromosomer) hos en av foreldrene eller hos fosteret. I 1959 oppdaget Lejeune at pasienter med Downs syndrom hadde en ekstra kopi av kromosom 21. Downs syndrom kalles også trisomi 21.

Andre numeriske abnormiteter som oppdages inkluderer kjønns -kromosomavvik. En hunn med bare ett X -kromosom har Turners syndrom , mens et ekstra X -kromosom hos en mann, som resulterer i totalt 47 kromosomer, har Klinefelters syndrom . Mange andre kjønnskromosomkombinasjoner er kompatible med levende fødsel, inkludert XXX, XYY og XXXX. Pattedyrs evne til å tolerere aneuploidier i kjønnskromosomene oppstår fra evnen til å inaktivere dem , noe som er nødvendig hos normale kvinner for å kompensere for å ha to kopier av kromosomet. Ikke alle gener på X -kromosomet er inaktiverte, og det er derfor det er en fenotypisk effekt sett hos individer med ekstra X -kromosomer.

Trisomi 13 var assosiert med Patau syndrom og trisomi 18 med Edwards syndrom .

I 1960 oppdaget Peter Nowell og David Hungerford et lite kromosom i de hvite blodlegemene til pasienter med kronisk myelogen leukemi (CML). Dette unormale kromosomet ble kalt Philadelphia -kromosomet - ettersom begge forskerne forsket i Philadelphia, Pennsylvania . Tretten år senere, med utviklingen av mer avanserte teknikker, ble det unormale kromosomet vist av Janet Rowley som et resultat av en translokasjon av kromosomer 9 og 22. Identifikasjon av Philadelphia -kromosomet ved cytogenetikk er diagnostisk for CML.

Advent av banding teknikker

Menneskelig mannlig karyotype.

På slutten av 1960-tallet utviklet Torbjörn Caspersson en kinakrin fluorescerende fargeteknikk (Q-banding) som avslørte unike båndmønstre for hvert kromosompar. Dette tillot kromosompar med ellers like størrelse å bli differensiert med distinkte horisontale båndmønstre. Båndmønstre brukes nå for å belyse bruddpunktene og kromosomene som er involvert i kromosomtranslokasjoner . Slettinger og inversjoner i et individuelt kromosom kan også identifiseres og beskrives mer presist ved bruk av standardisert banding -nomenklatur. G-banding (ved bruk av trypsin og Giemsa/ Wright-flekk) ble samtidig utviklet på begynnelsen av 1970-tallet og tillater visualisering av bandingsmønstre ved hjelp av et lyst feltmikroskop.

Diagrammer som identifiserer kromosomene basert på båndmønstrene er kjent som idiogrammer . Disse kartene ble grunnlaget for både prenatale og onkologiske felt for raskt å flytte cytogenetikk inn i det kliniske laboratoriet der karyotyping tillot forskere å lete etter kromosomforandringer. Teknikkene ble utvidet for å muliggjøre kultur av frie fostervann utvunnet fra fostervann , og forlengelsesteknikker for alle kulturtyper som gir mulighet for banding med høyere oppløsning.

Begynnelsen på molekylær cytogenetikk

På 1980 -tallet ble det gjort fremskritt innen molekylær cytogenetikk . Mens radioisotopmerkede sonder hadde blitt hybridisert med DNA siden 1969, ble det nå bevegelse ved bruk av fluorescerende merkede prober. Hybridisering av dem til kromosompreparater ved bruk av eksisterende teknikker ble kjent som fluorescens in situ hybridisering (FISH). Denne endringen økte bruken av sonderingsteknikker betydelig, da fluorescerende merkede sonder er sikrere. Ytterligere fremskritt innen mikromanipulering og undersøkelse av kromosomer førte til teknikken for kromosom mikrodisseksjon der aberrasjoner i kromosomstruktur kunne isoleres, klones og studeres i stadig større detalj.

Teknikker

Karyotyping

Rutinen kromosomanalyse ( karyotypering ) refererer til analysen av metafase- kromosomer som er blitt båndede ved hjelp av trypsin , etterfulgt av Giemsa , Leishmanns, eller en blanding av de to. Dette skaper unike båndmønstre på kromosomene. Den molekylære mekanismen og årsaken til disse mønstrene er ukjent, selv om det sannsynligvis er relatert til replikeringstidspunkt og kromatinpakning.

Flere teknikker for kromosombinding brukes i cytogenetiske laboratorier. Quinacrine banding (Q-banding) var den første fargemetoden som ble brukt for å produsere spesifikke bandingsmønstre. Denne metoden krever et fluorescensmikroskop og er ikke lenger så mye brukt som Giemsa- banding (G-banding). Omvendt bånding, eller R-bånding, krever varmebehandling og reverserer det vanlige svart-hvite mønsteret som ses i G-bånd og Q-bånd. Denne metoden er spesielt nyttig for farging av de distale endene av kromosomer. Andre fargeteknikker inkluderer C-banding og nukleolar organiserende region flekker (NOR flekker). Disse sistnevnte metodene flekker spesifikt visse deler av kromosomet. C-banding flekker det konstituerende heterokromatinet , som vanligvis ligger i nærheten av sentromeren, og NOR-farging fremhever satellittene og stilkene til akrosentriske kromosomer .

Høyoppløselig banding innebærer farging av kromosomer under profase eller tidlig metafase (prometafase), før de når maksimal kondens. Fordi profase- og prometafasekromosomer er mer utvidede enn metafasekromosomer, øker antallet bånd som kan observeres for alle kromosomer fra omtrent 300 til 450 til så mange som 800. Dette tillater påvisning av mindre åpenbare abnormiteter som vanligvis ikke sees med konvensjonell banding.

Lysbildeforberedelse

Celler fra benmarg , blod, fostervann, ledningsblod , svulst og vev (inkludert hud, navlestreng , chorionic villi, lever og mange andre organer) kan dyrkes ved bruk av standard cellekultursteknikker for å øke antallet. En mitotisk hemmer ( colchicine , colcemid ) tilsettes deretter til kulturen. Dette stopper celledeling ved mitose som tillater et økt utbytte av mitotiske celler for analyse. Cellene sentrifugeres og medier og mitotisk hemmer fjernes og erstattes med en hypoton løsning. Dette får de hvite blodlegemene eller fibroblastene til å hovne opp slik at kromosomene vil spre seg når de legges til et lysbilde, samt lyserer de røde blodcellene. Etter at cellene har fått sitte i en hypoton løsning, tilsettes Carnoys fikseringsmiddel (3: 1 metanol til iseddik ). Dette dreper cellene og herder kjernene til de resterende hvite blodlegemene. Cellene er vanligvis fikset gjentatte ganger for å fjerne rusk eller gjenværende røde blodlegemer. Cellesuspensjonen slippes deretter på objektglass. Etter aldring av lysbildene i en ovn eller venting i noen dager, er de klare for banding og analyse.

Analyse

Analyse av båndede kromosomer utføres i et mikroskop av en klinisk laboratoriespesialist i cytogenetikk (CLSp (CG)). Vanligvis analyseres 20 celler som er nok til å utelukke mosaikk til et akseptabelt nivå. Resultatene er oppsummert og gitt til en tavle-sertifisert cytogenetiker for gjennomgang, og for å skrive en tolkning som tar hensyn til pasientens tidligere historie og andre kliniske funn. Resultatene blir deretter gitt ut rapportert i et International System for Human Cytogenetic Nomenclature 2009 (ISCN2009).

Fluorescerende in situ hybridisering

Interfaseceller positive for (9; 22) omorganisering

Fluorescerende in situ hybridisering (FISH) refererer til bruk av fluorescerende merket probe for å hybridisere til cytogenetiske cellepreparater.

I tillegg til standardpreparater kan FISH også utføres på:

Lysbildeforberedelse

Denne delen refererer til fremstilling av standard cytogenetiske preparater

Lysbildet eldes ved bruk av en saltløsning som vanligvis består av 2X SSC (salt, natriumcitrat). Objektglassene dehydreres deretter i etanol , og sondeblandingen tilsettes. Prøve- DNA og probe-DNA co-denatureres deretter ved bruk av en oppvarmet plate og får lov til å gløde på nytt i minst 4 timer. Objektglassene vaskes deretter for å fjerne overflødig ubundet probe, og motfarges med 4 ', 6-Diamidino-2-fenylindol ( DAPI ) eller propidiumjodid.

Analyse

Analyse av FISH -prøver utføres ved fluorescensmikroskopi av en klinisk laboratoriespesialist i cytogenetikk. For onkologi blir generelt et stort antall interfaseceller skåret for å utelukke lavt nivå av residual sykdom, vanligvis mellom 200 og 1000 celler telles og scorer. For medfødte problemer blir vanligvis 20 metafaseceller scoret.

Fremtiden for cytogenetikk

Fremskritt fokuserer nå på molekylær cytogenetikk inkludert automatiserte systemer for å telle resultatene av standard FISH -preparater og teknikker for virtuell karyotyping , for eksempel komparative genomiske hybridiseringsarrayer, CGH og Single nucleotide polymorphism arrays.

Se også

Referanser

Eksterne linker